康曉亮，朱世高，陳述海，孫兆偉，朱呈瞻，馮玉杰，褚國慶，楊堃，張炳遠

(1青島大學附屬醫(yī)院，山東青島266003；2濰坊市中醫(yī)院)

膽管癌具有高轉移率、高病死率的特點，是最致命的惡性腫瘤之一。目前對膽管癌最有效的治療方法是根治性手術切除，然而大多數患者確診時已是晚期，失去了手術機會，化療及放療效果也不佳，預后很差。因此迫切需要尋找新的、有效的細胞毒藥物來治療。中醫(yī)藥用于治療腫瘤已取得一定成效。大量研究證實，中醫(yī)藥具有清熱解毒、軟堅散結、理氣健脾、攻毒消積、益氣養(yǎng)陰等多重功效，不僅能有效誘導腫瘤細胞凋亡，特異性殺傷腫瘤細胞，而且對正常組織和細胞的不良反應小[1]，可作為腫瘤綜合性治療措施之一。我們的前期研究顯示，中藥復方抑瘤飲能夠在體外抑制肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲，并促進其凋亡，在動物模型中也驗證了該藥抑制肝腫瘤生長的功效[2]。2017年8月～2018年3月，我們觀察了抑瘤飲對膽管癌細胞增殖和凋亡的影響，探討其對膽管癌的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人膽管癌QBC939細胞來自青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室。抑瘤飲組方：黃芪2 g，靈芝1 g，苦杏仁1 g，白花蛇舌草3 g，附子2 g，光果甘草2 g，西洋參1 g，桔梗1 g；均購自福建百草堂藥業(yè)有限公司，由濰坊市中醫(yī)院制成120 mg/mL藥液，-20 ℃儲存。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、0.25%胰酶消化液(美國Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)；Hoechst 33258(北京索萊寶生物科技有限公司)，CCK-8凋亡檢測試劑盒(廣州奕源生物科技有限公司)，流式凋亡檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，細胞凋亡相關蛋白PARP抗體、Caspase-9抗體、Caspase-12抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體及GAPDH抗體(美國CST公司)。FACSCAI IBUR流式細胞儀(美國BD公司)，SAFIRE II-BASIC酶標儀(澳大利亞Tecan公司)；FUSION FX7活體成像分析儀(法國Vilber Lourmat公司)；IX73P2F倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及干預 將細胞加入含RPMI-1640、10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱。待細胞長滿后，加入0.25%胰酶消化，以1∶2的比例傳代。取對數生長期細胞，隨機分為抑瘤飲低、中、高濃度組和對照組，抑瘤飲低、中、高濃度組分別加入6、8、12 mg/mL抑瘤飲，對照組加入PBS，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞形態(tài)學觀察 采用Hoechst 33258熒光染色。從24孔板中取出細胞爬片，PBS沖洗，甲醇固定。Hoechst 33258避光染色30 min，PBS沖洗、超純水沖洗，抗淬滅劑封片。避光條件下，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 細胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。細胞培養(yǎng)24 h后，向96孔板各孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h后，用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度OD值。細胞增殖抑制率=(1-實驗組細胞OD值/對照組細胞OD值)×100%。用同樣的方法檢測培養(yǎng)48 h后細胞的吸光度OD值，計算細胞增殖抑制率。

1.5 細胞凋亡觀察 采用流式細胞術。取培養(yǎng)24 h的細胞，消化、離心，用PBS沖洗2遍。每組細胞加入1×Binging buffer結合緩沖液重懸細胞至1×106/mL，分別取100 μL重懸液(1×105/mL)加入1.5 mL EP管中，再分別加入PI染液，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，上流式細胞儀檢測。數據采用FlowJo7.6.1軟件進行處理，計算細胞凋亡率。

1.6 細胞內相關凋亡蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取培養(yǎng)24 h的細胞，消化、離心，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。制作10%的SDS-聚丙烯凝膠，蛋白樣品按20 μL的體系上樣，經電泳、轉膜、封閉后，分別加入兔抗PARP多克隆抗體、鼠抗Caspase-9單克隆抗體、兔抗Caspase-12多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體和兔抗GAPDH單克隆抗體，孵育過夜。采用Vilber Fusion FX7成像系統(tǒng)顯影采集圖像，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞形態(tài) 對照組細胞核形態(tài)規(guī)則完整，核膜光滑，細胞核較大，熒光分布均勻；而抑瘤飲高濃度組細胞呈明顯的形態(tài)學改變，細胞核染色質固縮，核內熒光分布不均勻，出現畸形核。

2.2 各組細胞增殖抑制率比較 抑瘤飲各濃度組細胞增殖抑制率均高于對照組，其中抑瘤飲高濃度組細胞增殖抑制率高于低、中濃度組，各組48 h時的細胞增殖抑制率高于24 h(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

注：與同組24 h比較，*P<0.05；與抑瘤飲低濃度組同時點比較，#P<0.01；與抑瘤飲中濃度組同時點比較，△P<0.01。

2.3 各組細胞凋亡率比較 抑瘤飲低、中、高濃度組和對照組的細胞凋亡率分別為5.05%±0.79%、9.20%±1.12%、17.10%±1.91%、3.32%±0.73%。與對照組比較，抑瘤飲各濃度組細胞凋亡率均升高(P均<0.05)。

2.4 各組細胞凋亡相關蛋白表達比較 抑瘤飲各濃度組PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bax蛋白表達均高于對照組，Bcl-2蛋白表達均低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞凋亡相關蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

膽管癌是一種原發(fā)于不同部位膽管上皮細胞的惡性腫瘤，具有局部侵襲性和高轉移率，預后差。目前對膽管癌治療最有效的方法是根治性手術切除，然而膽管癌早期進展在很大程度上是無癥狀的，大多數患者確診時已是晚期，無法行根治性手術，預后很差，總體5年生存率小于5%[3]。即使進行了完全性手術切除的患者，仍有50%以上最終發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉移[4]。由于膽管癌對放療、化療均不敏感，目前還缺乏系統(tǒng)性治療手段，其確診后的平均生存時間僅為12個月[5]，因此迫切需要尋找新的、有效的藥物來治療膽管癌患者。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞增殖與凋亡的平衡失調有關，因此誘導腫瘤細胞凋亡成為治療的新方向。我國傳統(tǒng)醫(yī)學認為，膽管癌屬消化系統(tǒng)惡性腫瘤范疇，其惡性程度高、預后差，平均生存期短；應該采取祛邪而不傷正、扶正而不留邪的治療原則，采用健脾益氣、補氣養(yǎng)血之法固其本，同時予以清利濕熱、退黃、解毒散結、抑瘤治其標，固本祛邪，整體抑瘤，既能有效地抑殺腫瘤細胞，改善人體失調的內環(huán)境，加強機體對癌細胞的監(jiān)控能力，同時誘導癌細胞自我凋亡或誘導其分化，使癌細胞在無不良反應的情況下逐步萎縮，從而能對膽管癌患者產生較好的治療效果，達到減輕癥狀、延長生命的目的。

抑瘤飲是由黃芪、靈芝、苦杏仁、白花蛇舌草、附子、光果甘草、西洋參、桔梗8味中藥組成的復方制劑。本研究結果顯示，抑瘤飲能有效抑制膽管癌QBC939細胞的增殖；在相同時間段，隨著抑瘤飲濃度的增加，細胞增殖抑制率逐漸升高；而在相同濃度的抑瘤飲時，隨著作用時間的延長，細胞增殖抑制率也隨之升高；說明抑瘤飲對膽管癌細胞的抑制作用具有時間和濃度依賴性。Hoechst 33258染料是一種無毒的DNA染料，可作為熒光探針與DNA結合，其能夠穿透細胞膜，對活細胞的染色呈漸進性，熒光顯微鏡下呈均勻的藍色熒光。而凋亡細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，染色體固縮，DNA發(fā)生裂解，胞核內的DNA結構發(fā)生改變，使得染料更容易與DNA結合，因此會出現染色增強的現象。本研究結果顯示，與對照組比較，抑瘤飲高濃度組細胞呈明顯的形態(tài)學改變，細胞核染色質固縮，核內熒光分布不均勻，出現畸形核。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡[6]，是一種有核細胞調控的生理過程，主要通過內源性DNA內切酶的激活發(fā)生的自動死亡過程，被認為是精細控制的程序性細胞死亡途徑。其特點為細胞萎縮、膜起泡和DNA碎片等，造成DNA含量降低，通過流式細胞儀檢測時，就會形成亞二倍體峰，根據此峰能計算出細胞凋亡率。本研究結果顯示，抑瘤飲各濃度組細胞凋亡率升高，并隨著藥物濃度的增加，凋亡率也隨之升高。大量研究證實，細胞凋亡的過程中包含著多種信號轉導通路的激活。依賴于Caspase的凋亡途徑包括外源信號途徑和內源信號途徑，后者主要以線粒體的損傷，從而激活下游的凋亡分子蛋白。為了進一步探索抑瘤飲誘導膽管癌細胞的凋亡機制，我們檢測了抑瘤飲對依賴于Caspase凋亡途徑的相關蛋白PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bcl-2、Bax蛋白表達水平的影響。早期研究表明，線粒體膜的破壞和線粒體膜電位降低是氧化應激誘導的凋亡性細胞死亡的生物標記[7]。Bcl-2家族和半胱氨酸蛋白酶中的一些促凋亡和抑凋亡蛋白被認為是凋亡途徑的執(zhí)行者[8，9]。其中，Bcl-2和Bax是兩類典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，細胞的凋亡取決于促凋亡成員和抑凋亡成員的相對濃度。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡，Bcl-2/Bax直接決定了線粒體外膜的各種通道的通透性，從而決定了細胞的生存與否[10]。再者，Caspase-12和鈣蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中的兩個成員，其在調節(jié)病理性細胞死亡中發(fā)揮著重要作用；鈣蛋白酶是一種位于內質網中的半胱氨酸內肽酶，其可能負責切割前體Caspase-12，從而激活Caspase-12；Caspase-12缺陷型細胞對內質網應激誘導因子具有抗性，表明Caspase-12可能參與內質網應激誘導的細胞凋亡[11～14]。Caspase-12從內質網易位至細胞質中，然后直接切割前體Caspase-9，在線粒體膜電位減少的共同作用下，Caspase-9反過來激活Caspase-3[15]，最終激活PARP因子，并隨后響應抑瘤飲在膽管癌細胞中PARP蛋白表達的增高，導致細胞凋亡。本研究結果顯示，與對照組比較，抑瘤飲各濃度組顯著上調促凋亡PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bax蛋白，而下調抑凋亡Bcl-2蛋白。推測依賴于Caspase的內源信號凋亡途徑可能是抑瘤飲介導膽管癌QBC939細胞凋亡的分子機制。

綜上所述，中藥復方抑瘤飲能夠有效抑制體外膽管癌細胞的增殖并促進其凋亡，其凋亡通路可能是依賴于Caspase的內源信號凋亡途徑。其對膽管癌的其他作用機制還有待進一步研究。

(收稿日期：2018-06-27)