楊婭平，李棟梁，曹瑋，趙田華

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院)

范可尼貧血(FA)是一種罕見的常染色體或X染色體連鎖的隱性遺傳病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的造血功能衰竭、先天性畸形及高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為急性髓系白血病[2]，約50%的患者呈原發(fā)不孕[3，4]。FA的發(fā)生源于FA基因突變。FA基因是一組在DNA交聯(lián)損傷中起同源重組修復(fù)(HRR)作用的基因[1]，其常見的突變類型包括FANCA、FANCC和FANCG。目前認(rèn)為，F(xiàn)A是由于DNA內(nèi)切酶異常阻礙了受損DNA自然修復(fù)過程，進(jìn)而引起染色體畸變，最終導(dǎo)致造血干細(xì)胞缺陷及多發(fā)性畸形。常規(guī)診斷FA主要依據(jù)全血細(xì)胞減少家族史、骨髓再生障礙、特征性先天畸形及染色體斷裂等。目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的測(cè)序技術(shù)，能夠同時(shí)篩查多種基因突變。我們應(yīng)用此技術(shù)檢出1例FA患兒攜帶FANCA基因雙重突變，用Sanger測(cè)序法加以驗(yàn)證并檢測(cè)其父母、姐姐基因型?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒女，9歲，因“間斷乏力、鼻衄1年10月余”，于2015年11月6日來我院就診。患兒既往在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院依據(jù)血常規(guī)、骨髓穿刺結(jié)果考慮再生障礙性貧血(具體檢查結(jié)果未知)，日常間斷口服康力龍及環(huán)孢素治療，療效不滿意?；純焊改阜墙H結(jié)婚，家族中無類似疾病史。查體：發(fā)育落后于同齡兒，無骨骼畸形，中度貧血貌，皮膚未見色素沉著及出血點(diǎn)，心臟未聞及異常雜音，肝脾肋下未觸及腫大。實(shí)驗(yàn)室檢查：①血常規(guī)：白細(xì)胞3.0×109/L，中性粒細(xì)胞36.5%，淋巴細(xì)胞60.8%，紅細(xì)胞2.6×1012/L，血紅蛋白102.0 g/L，血小板38.0×109/L。②骨髓象：有核細(xì)胞增生減低，粒系比例略低，占26.5%，均為中幼及以下階段，胞質(zhì)顆粒明顯增多；紅系比例明顯增高，占57.5%，以中晚幼紅細(xì)胞為主，偶見雙核紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞大小不一；淋巴細(xì)胞比例基本正常；全片共見巨核細(xì)胞4個(gè)，血小板散在少見。③骨髓活檢：骨髓增生極度低下(10%)，伴明顯出血，少量粒、紅系細(xì)胞散在分布，分葉核為主，巨核細(xì)胞可見，偶見胞體小的巨核細(xì)胞。網(wǎng)狀纖維染色(MF)0級(jí)。免疫組化：CD34、CD14、CD117陰性，CD61、CD42b、MPO陽性，CD68少數(shù)陽性。④骨髓增生異常綜合征(MDS)及白血病相關(guān)基因檢測(cè)：骨髓細(xì)胞FISH檢查MDS、白血病相關(guān)基因EGR1、CEP7、TP53、CEP8均未見異常；Sanger測(cè)序示MDS、白血病相關(guān)基因IDH1、IDH2、NPM1、DNMT3A、SRSF2、SF3B1及U2AF1均未見異常。④染色體分析：核型為46，XX；染色體斷裂實(shí)驗(yàn)未見異常。⑤腎臟B超：左腎缺如，右腎融合腎?？紤]患兒年幼伴發(fā)先天畸形，發(fā)育遲緩，間斷口服康力龍及環(huán)孢素癥狀緩解差，可能為骨髓衰竭綜合征，尤以FA為著，因此做FA相關(guān)檢查。以50例健康志愿者作為對(duì)照排除基因多態(tài)性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得患兒及家屬知情同意。

1.2 患兒FANCA突變基因檢測(cè)及驗(yàn)證

1.2.1 基因組DNA提取 采集患兒外周血3～5 mL，EDTA抗凝，按DNA提取試劑盒說明書提取外周血DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 FANCA突變基因檢測(cè) 采用目標(biāo)序列捕獲和高通量測(cè)序技術(shù)。利用基于第二代測(cè)序方法設(shè)計(jì)的包含249種先天性骨髓衰竭癥的診斷試劑盒，首先將提取的基因組DNA用超聲波打斷并制備DNA文庫，然后通過捕獲芯片對(duì)FANCA基因編碼區(qū)及其側(cè)翼序列的DNA進(jìn)行富集，用通用引物對(duì)捕獲到的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后應(yīng)用Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，尋找突變的致病基因。

1.2.3 FANCA突變基因鑒定 采用Sanger測(cè)序技術(shù)。在確定患兒突變的致病基因后，對(duì)患兒外周血DNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier5.0軟件，由上海生工生物合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板5 μL，10×PCR緩沖液5 μL，l×dNTP 5 μL，Taq酶2 U，上、下游引物各1.5 μL，補(bǔ)雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，55～65 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察。DNA測(cè)序：PCR產(chǎn)物純化后，用測(cè)序試劑盒在ABI3130 DNA測(cè)序儀上進(jìn)行序列測(cè)定。將檢測(cè)結(jié)果與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)進(jìn)行比對(duì)，確定有無此類突變的報(bào)道。另外對(duì)50例健康人進(jìn)行該基因突變的篩查作為陰性對(duì)照。

1.3 患兒家系直系成員FANCA突變基因檢測(cè) 采集患兒父母、姐姐的外周血，采用Sanger測(cè)序技術(shù)檢測(cè)外周血DNA的基因型。方法同上。

1.4 突變危害性的預(yù)測(cè) 應(yīng)用Mutation Taster和PolyPhen-2軟件預(yù)測(cè)基因突變對(duì)蛋白功能的影響程度。當(dāng)兩種軟件均預(yù)測(cè)同一突變對(duì)蛋白的功能影響較大時(shí)，認(rèn)定該突變具有較強(qiáng)的危害性。

2 結(jié)果

2.1 患兒FANCA突變基因檢測(cè)結(jié)果 目標(biāo)序列捕獲測(cè)序分析FANCA基因上所有外顯子的測(cè)序覆蓋率均達(dá)到99%以上，各外顯子上的平均測(cè)序深度和測(cè)序深度中位數(shù)均比較接近，提示測(cè)序的隨機(jī)性比較好。通過目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)患兒FANCA基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)16號(hào)染色體上FANCA基因編碼區(qū)存在雙重雜合突變，即第14外顯子c.1303C>T(p.R435C)和第31外顯子c.3031C>T(p.R1011C)，導(dǎo)致該基因的第435位和1011位氨基酸均由精氨酸變成半胱氨酸。見圖1、2。

圖1 患兒FANCA基因c.1303C>T突變目標(biāo)序列捕獲和高通量測(cè)序圖

圖2 患兒FANCA基因c.3031C>T突變目標(biāo)序列捕獲和高通量測(cè)序圖

2.2 患兒FANCA突變基因驗(yàn)證結(jié)果 應(yīng)用Sanger測(cè)序法對(duì)先證者的上述突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序法完全一致。見圖3、4。對(duì)50例健康個(gè)體FANCA基因相應(yīng)區(qū)域測(cè)序，均未發(fā)現(xiàn)上述序列改變。

圖3 患兒FANCA基因c.1303C>T突變Sanger測(cè)序圖

圖4 患兒FANCA基因c.3031C>T突變Sanger測(cè)序圖

2.3 患兒家系直系成員FANCA突變基因檢測(cè)結(jié)果 父親攜帶第31外顯子c.3031C>T(p.R1011C)突變，母親及姐姐均攜帶第14外顯子c.1303C>T(p.R435C)突變。

2.4 蛋白功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果 c.3031C>T(p. R1011C)和c.1303C>T(p.R435C)對(duì)蛋白功能影響均為有害。

3 討論

多數(shù)FA患者出生時(shí)血細(xì)胞正?；蚪咏?，在5～10歲時(shí)出現(xiàn)血細(xì)胞減少[5]，常合并貧血、出血和感染，部分患者表現(xiàn)為進(jìn)行性骨髓衰竭與繼發(fā)性腫瘤如急性髓系白血病等，造血功能衰竭合并感染為該病常見的死亡原因。隨著年齡增長(zhǎng)，F(xiàn)A患者可出現(xiàn)多發(fā)畸形與發(fā)育遲滯，其中畸形的發(fā)生率約為60%[6]。FA的實(shí)驗(yàn)室檢查包括血象、骨髓象及細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)等。其血液學(xué)改變程度和類型呈高度異質(zhì)性；骨髓象類似于獲得性再障，表現(xiàn)為增生減低、造血細(xì)胞減少、非造血細(xì)胞增多；細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)可見染色體斷裂、缺失，染色單體互換、核內(nèi)再復(fù)制、環(huán)形染色體畸變等不穩(wěn)定現(xiàn)象。Auerbach等[7]報(bào)道了222例FA患者，其中44%表現(xiàn)為骨髓造血異常和先天畸形，51%僅有造血異常或先天畸形，5%兩者皆無。但也有再障患兒伴先天畸形而無細(xì)胞遺傳學(xué)改變者，因此僅靠臨床表現(xiàn)可能漏診或誤診。本例患兒自幼身材矮小，發(fā)育遲于同齡正常兒童，7歲左右出現(xiàn)乏力、鼻衄癥狀，血常規(guī)提示全血細(xì)胞減少，骨髓象提示骨髓造血功能低下，超聲發(fā)現(xiàn)左腎缺如及右側(cè)融合腎，符合FA患者發(fā)育遲緩、骨髓造血衰竭及先天畸形的臨床特點(diǎn)。

近年來，利用體細(xì)胞融合雜交技術(shù)和FA細(xì)胞對(duì)DNA交鏈劑異常敏感的基因缺陷進(jìn)行互補(bǔ)分析，目前已發(fā)現(xiàn)有19種基因被證實(shí)參與FA蛋白的相關(guān)功能。這些基因以“FANC”為詞根進(jìn)行命名，F(xiàn)ANCA、FANCC和FANCG是3種較為常見的基因突變，約占FA患者的85%，其中FANCA基因亞型最為常見[8]。FANCA約有200個(gè)不同的等位基因，包括幾乎所有的已知的突變類型，大片段的缺失是主要的突變類型。轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常綜合征及白血病的FA通常有基因或染色體異常，其中7號(hào)和3q異常的預(yù)后差[9，10]。

目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序是將目標(biāo)序列捕獲與高通量測(cè)序相整合進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)，具有速度快、準(zhǔn)確率高、成本低、覆蓋度廣以及與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)檢測(cè)大量基因，適用于遺傳異質(zhì)性疾病的基因突變篩查，具有很好的應(yīng)用潛力，亦為檢測(cè)FA相關(guān)的基因突變提供了更為準(zhǔn)確和直觀的診斷依據(jù)。本研究應(yīng)用該技術(shù)對(duì)1例疑似FA患兒進(jìn)行了249種骨髓衰竭癥相關(guān)基因突變的篩查，發(fā)現(xiàn)本例患兒存在16號(hào)染色體上FANCA基因第14外顯子c.1303C>T和第31外顯子c.3031C>T雙重雜合突變，并用Sanger測(cè)序得以驗(yàn)證，從而確定了FA的診斷。有關(guān)FANCA基因14外顯子c.1303C>T突變國(guó)內(nèi)外僅見1例報(bào)道，即在97例FA患者中檢測(cè)到40種致病基因突變位點(diǎn)，其中1例為c.1303C>T突變，且此突變與FA發(fā)病密切相關(guān)[11]；后一突變位點(diǎn)通過查詢千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(HGMD)和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)目前尚未見報(bào)道。我們進(jìn)一步應(yīng)用蛋白功能預(yù)測(cè)軟件檢索提示，上述2個(gè)突變對(duì)蛋白功能影響均為有害。

FA的治療首選異基因造血干細(xì)胞移植，可修復(fù)受損細(xì)胞及改善FA造血微環(huán)境，是提高患者長(zhǎng)期無病生存率的惟一方法；無移植條件者可給予雄激素、細(xì)胞因子如粒細(xì)胞集落刺激因子及對(duì)癥支持治療。該患兒平時(shí)間斷口服雄激素及輸血治療，目前病情穩(wěn)定，正在進(jìn)一步隨訪中。