林振華，侯麗，董傳俊，魏振西，朱福余，褚祥宇，展榮凱

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心/山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101

引言

膠原蛋白主要分布于皮膚、肌腱等組織，經(jīng)過(guò)病毒滅活、去脂、酶切等工藝制備而成。由于去除了能夠引起免疫原性的端肽，具有低免疫原性和可降解性。膠原蛋白止血海綿狀結(jié)構(gòu)具有良好的滲水和吸水能力，局部止血時(shí)能很好的吸收出血，同時(shí)加強(qiáng)血小板的粘附和聚集，并啟動(dòng)內(nèi)源性的止血途徑，從而達(dá)到止血效果[1-2]。目前膠原蛋白已被廣泛應(yīng)用于制備醫(yī)療材料，其生物安全性等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛認(rèn)可，但是作為可降解的止血材料，其止血有效性在大動(dòng)物出血模型中，需要繼續(xù)研究。將兩組不同的膠原蛋白海綿及普通紗布用于豬的肝臟出血模型中進(jìn)行比較研究，來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)膠原蛋白作為止血材料的優(yōu)勢(shì)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

呼吸麻醉機(jī)（型號(hào)WATO EX-20，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），獸用便攜式多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀（型號(hào)iMEC8 Vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），壓力傳感系統(tǒng)（LCKD-1kg型壓力表，DP25B-S-230型壓力傳感器，OMEGA），分析天平（型號(hào)JA2003N，200 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司），正置顯微鏡（型號(hào)BX53/DP73，日本Olympus），TissUE-Tek自動(dòng)組織染色封片工作站（型號(hào)Tissue-Tek Prisma 6133-Glas g2，日本櫻花精機(jī)會(huì)社），HM355S全自動(dòng)切片機(jī)（型號(hào)HM355S，美國(guó)賽默飛世爾），組織脫水機(jī)（型號(hào)Excelsior AS，美國(guó)Thermo），自動(dòng)組織包埋機(jī)（型號(hào)Histostar，美國(guó)Thermo）。A組膠原蛋白海綿（4.5 cm×4.5 cm×0.5 cm，廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司），B組醫(yī)用膠原蛋白海綿（100 mm×50 mm×5 mm，上海其勝生物制劑有限公司），無(wú)菌紗布（6 cm×8 cm，8層A型）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)用小型豬18頭[天津市百農(nóng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（津）2015-0002]，雌性未孕，體重30～40 kg，隨機(jī)分為A、B、C三組：A組為膠原蛋白海綿組；B組為醫(yī)用膠原蛋白海綿組；C組為普通紗布組。每組6頭。本研究獲得山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的處理符合倫理要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 出血模型的建立

動(dòng)物術(shù)前24 h禁飼不禁水。按0.5 mL/kg的劑量，通過(guò)耳靜脈一次性注射丙泊酚注射液進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。誘導(dǎo)麻醉后，進(jìn)行氣管插管，連接呼吸麻醉機(jī)，使用異氟烷進(jìn)行氣體維持麻醉。動(dòng)物仰臥位，于肝臟相應(yīng)皮膚部位剃毛，備皮區(qū)約15 cm×20 cm，清潔后用碘伏進(jìn)行徹底消毒，鋪上蓋單、洞巾等，暴露切口部位。確認(rèn)動(dòng)物麻醉（肌肉松弛）后，于暴露切口部位做約4 cm切口，鈍性分離腹外斜肌和內(nèi)斜肌，剪開(kāi)腹膜，暴露肝臟。將肝臟用手術(shù)刀劃出長(zhǎng)2 cm，深3 mm的傷口（傷口部位在距肝臟邊緣3 cm處）。

1.3.2 止血方法

A組于10 s內(nèi)將一片膠原蛋白海綿完全覆蓋在傷口上，并覆蓋無(wú)菌紗布?jí)K，使用壓力傳感系統(tǒng)進(jìn)行按壓，按壓力度為（10±2）N。每30 s觀察一次止血情況（僅拿開(kāi)無(wú)菌紗布?jí)K觀察止血情況），如未能止血，繼續(xù)覆蓋另一塊無(wú)菌紗布?jí)K按壓，直至止血（連續(xù)觀察10 min，仍不能有效止血?jiǎng)t視為不能止血）。止血后記錄止血時(shí)間及出血量。B組同法操作；C組僅使用無(wú)菌紗布同法操作。

1.4 主要觀察指標(biāo)

1.4.1 止血時(shí)間

觀察并記錄止血時(shí)間，以時(shí)間單位（s）記錄止血時(shí)間。使用秒表讀數(shù)方式觀察并記錄止血時(shí)間。

1.4.2 出血量

觀察并記錄出血量[3]，以重量單位（g）記錄出血量。先將無(wú)菌紗布稱重，止血完成后，將帶有血液的無(wú)菌紗布再次稱重。止血后無(wú)菌紗布的重量減去止血前無(wú)菌紗布的重量即為出血量。

1.4.3 病理學(xué)檢查

術(shù)后8周，采用安樂(lè)死的方法處死所有動(dòng)物，進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察創(chuàng)面血性莢膜形成情況，取肝臟創(chuàng)面用10%中性福爾馬林固定，HE染色，觀察炎癥反應(yīng)情況和創(chuàng)口愈合情況等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0對(duì)止血時(shí)間、出血量（表示為x-±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 止血時(shí)間和出血量

A組和C組止血時(shí)間和出血量均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。B組和C組止血時(shí)間和出血量均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 A組和C組肝臟止血時(shí)間和出血量結(jié)果

2.2 病理學(xué)檢查

取肝臟創(chuàng)面用10%的中性福爾馬林固定液固定，將固定后的組織經(jīng)石蠟包埋后切片，采用常規(guī)蘇木素—伊紅染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組動(dòng)物肝臟的創(chuàng)口周邊組織學(xué)反應(yīng)情況，結(jié)果如下。

A組創(chuàng)口處可見(jiàn)結(jié)締組織增生，可見(jiàn)少量增生的膠原纖維及成纖維細(xì)胞，可見(jiàn)少量含鐵血黃素沉著，未見(jiàn)感染性炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

B組創(chuàng)口處纖維結(jié)締組織增生，被膜增厚，可見(jiàn)少量增生的膠原纖維及成纖維細(xì)胞，創(chuàng)口處可見(jiàn)少量含鐵血黃素沉著，未見(jiàn)感染性炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖2。

C組可見(jiàn)結(jié)締組織增生，可見(jiàn)少量含鐵血黃素沉著，未見(jiàn)感染性炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖3。

圖2 B組創(chuàng)口處染色結(jié)果

圖3 C組創(chuàng)口處染色結(jié)果

病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，A、B、C三組肝臟創(chuàng)面均未見(jiàn)血性莢膜形成，肝臟創(chuàng)口未出現(xiàn)感染性炎癥反應(yīng)，肝臟創(chuàng)口愈合良好。

3 討論

本次研究選擇豬的肝臟損傷出血模型符合研究預(yù)期要求，肝臟屬于實(shí)質(zhì)性器官，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能繁多，有較大的動(dòng)、靜脈，也有豐富的毛細(xì)血管，具有豐富的血流[4]。未選擇小動(dòng)物肝臟出血模型進(jìn)行研究，主要考慮小動(dòng)物血容量小，出血時(shí)間和出血量相對(duì)偏小，模型具有局限性。

止血是血管、血小板及凝血因子的共同作用來(lái)完成[5]。其中，血小板在初期止血過(guò)程中起著重要的作用。止血過(guò)程中除了局部的加壓和止血材料的促凝作用外，還與止血材料的結(jié)構(gòu)有重要關(guān)系[6]。常規(guī)臨床手術(shù)中，大血管可以結(jié)扎阻斷，但不能解決毛細(xì)血管的止血問(wèn)題[7]。通過(guò)本次研究可知，以膠原蛋白為材料的止血海綿能夠較快速的解決實(shí)質(zhì)性臟器的出血問(wèn)題，明顯優(yōu)于普通紗布，為臨床手術(shù)節(jié)省大量時(shí)間。

臨床常用的可吸收止血材料有氧化纖維素、凝血酶制劑、膠原蛋白海綿、微孔多聚糖類止血粉、殼聚糖等[8]。眾多止血材料中，膠原蛋白有很好的生物學(xué)性能，具有可降解、低抗原、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)[9-16]。膠原蛋白獨(dú)特的三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)能夠吸附大量的組織液，能更有效地達(dá)到止血目的。此次研究結(jié)果表明以膠原蛋白為材料的止血海綿的止血有效性較普通紗布好，有明顯的止血作用，并且對(duì)創(chuàng)傷的副作用較小，符合臨床預(yù)期使用要求。