秦玉川，王麗玲，王衍彬，賀 亮，劉本同，錢 華，童曉青

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大苞鞘石斛中多糖DWW-1的提純及其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)分析

秦玉川，王麗玲，王衍彬，賀 亮，劉本同，錢 華，童曉青

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

從大苞鞘石斛中分離純化得到一種均一多糖組分DWW-1，采用化學(xué)和光譜學(xué)的方法對其理化性質(zhì)及初步結(jié)構(gòu)進行研究。首先采用水提醇沉方法制備大苞鞘的粗多糖，經(jīng)過Sevag法除蛋白，DEAE-Cellulose和Sephadex G-75柱層析分離純化得到均一多糖DWW-1純品。其次利用化學(xué)法、高效凝膠過濾色譜法、液相色譜法，并結(jié)合紅外光譜，對DWW-1進行性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示DWW-1為白色絮狀固體，易溶于水，分子量為6.479×104，糖基組成為葡萄糖、糖醛酸、甘露糖、巖藻糖四種單糖；多糖糖苷鍵以1→4連接鍵為主，1→3為次；其次DWW-1具有較強DPPH自由基清除活性。初步研究結(jié)果表明從大苞鞘石斛中分離到的是一種具有抗氧化活性多糖，并簡稱為DWW-1。

大苞鞘石斛；多糖；分離；理化性質(zhì)；結(jié)構(gòu)分析

大苞鞘石斛，又名騰沖石斛，為蘭科Orchidaceae石斛屬多年生附生蘭，生于海拔1 350 ~ 1 900 m的山地疏林中樹干上。產(chǎn)云南東南部至西部（金平、勐臘、鎮(zhèn)康、騰沖、盈江），在中國周邊國家不丹、緬甸、泰國、越南也有分布。目前關(guān)于大苞鞘石斛的研究主要集中在化學(xué)成分小分子[1]、種子萌發(fā)[2]、組培快繁[3]和低溫保存[4]等方面。

石斛中的活性物質(zhì)主要是多糖，為此國內(nèi)外的一些專家學(xué)者已開始對石斛多糖進行分離、純化和結(jié)構(gòu)分析[5-9]，但是到目前為止對于大苞鞘石斛化學(xué)成分方面的研究較少，僅有報道大苞鞘石斛多糖含量較高，但生物堿含量較少[10]；同時有學(xué)者從大苞鞘石斛中分離到鉤狀石斛素、愉悅石斛素、4'，5'，7'-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃烷酮、β-胡蘿卜苷和β-谷甾醇這5種活性成分[11]。為了研究大苞鞘石斛中多糖的主要結(jié)構(gòu)，本研究對大苞鞘石斛水溶性多糖成分進行提取、分離和純化, 并著重對大苞鞘石斛多糖DWW-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為大苞鞘石斛，采自浙江省杭州園林青山湖石斛基地，經(jīng)鑒定為成熟未開花的大苞鞘石斛。取成熟3年生秋季未開花大苞鞘石斛假鱗莖若干，切成1 ~ 2 cm的小段，蒸餾水洗凈，105℃殺青15 min，60℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎成粉末后過0.25 mm篩，置于干燥器備用。

1.2 試驗儀器與試劑

DG120型藥材粉碎機（浙江省瑞安市春海藥材器械廠）；二列四孔水浴HH-2K4（鞏義市予華儀器責(zé)任公司）；U-1900型可見分光光度計（日本HITACHI公司）；CL31R型多功能高速離心機（美國Thermo公司）；U-1900型可見分光光度計等。單糖對照品D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-葡萄糖醛酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 大苞鞘石斛粗多糖的提取 稱取干燥的大苞鞘石斛粉末50.00 g，加入30倍質(zhì)量的蒸餾水，90℃水浴加熱2 h。冷卻后7 200 r·min-1離心、抽濾，獲得濾液1 500 mL。將濾液真空濃縮至原有體積的1/6（旋蒸儀溫度90度）約為340 mL，加入4倍體積的乙醇，靜置12 h，7 200 r·min-1離心分離，得到沉淀。將沉淀物真空干燥，即為粗多糖。

1.3.2 粗多糖的分離與純化 采用Sevag法[12]除去游離的蛋白質(zhì)。取粗多糖5.00 g，加60 mL蒸餾水溶解。配制有機溶劑混合液（氯仿：正丁醇= 4:1），向粗多糖溶液中加入1/4體積的有機溶劑混合液，充分震蕩混勻，經(jīng)離心機13 200 r·min-1離心1 min，將水相和氯仿相分開，操作過程中，蛋白質(zhì)多出現(xiàn)于兩相界面處。在水相中加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)3 ~ 5次，直到震蕩后水層上不再有白色泡沫為止。

將除蛋白后的多糖溶液約20 mL（濃稠棕色）放入真空干燥箱（50℃，壓力為1.0×10-4Mpa）中干燥（除去有機溶劑）。干燥后用蒸餾水溶解，濃度為20.1 g·L-1，以8 000 r·min-1，離心5 min，除去不溶物后為大苞鞘石斛粗多糖組分Ⅰ。

將大苞鞘石斛粗多糖組分Ⅰ通過DEAE-纖維素柱，用梯度氯化鈉洗脫，流速12 mL·h-1，每4 mL收集1管，并用苯酚-硫酸法檢測，收集第一峰，得到的液體再經(jīng)過濃縮、透析、冷凍干燥，得多糖DWW-1。

1.3.3 單糖組成分析 多糖水解：稱取多糖DWW-1 3 mg，加入4 mol·L-1TFA（三氟乙酸）1 mL，置于具塞試管中、氮氣封口，121℃下水解6 h，結(jié)束后，冷卻至室溫，并加入200 μL甲醇，60℃真空，以8 000 r·min-1，5 min離心濃縮，反復(fù)3次，待衍生化。

每種單糖（5 mM），按照邵雙雙等[13]方法處理后，待高效液相色譜（HPLC）；

吹干的多糖水解液，按上述同樣的方法處理后，待HPLC。

RP-HPLC條件：檢測波長245 nm，流速1.0 mL·min-1；柱溫：室溫，上樣條件：10 μL，流動相A（乙腈）：流動相B（0.05 mol·L-1磷酸緩沖液，pH 6.9）=17:83。

1.3.4 分子量測定 采用靜態(tài)光散射和動態(tài)光散射系統(tǒng)（SEC-MALLS）進行測定，獲得多糖DWW-1的重均分子量（Mw）。

1.3.5 紅外光譜測定 取多糖樣品DWW-1 1 ~ 2 mg，運用溴化鉀（KBr）壓片法，將適量多糖樣品與干燥的溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，經(jīng)壓片機壓制成透明薄片，在紅外光譜儀下進行測定。紅外光譜儀測定參數(shù)如下：背景掃描32次；掃描范圍400 ~ 4 000 cm-1；分辨率4.0 cm-1；檢測器：DTGS。

1.3.6 高碘酸氧化 稱取多糖樣品DWW-1 50 mg，然后加入30 mM高碘酸鈉（NaIO4）25 mL，蒸餾水定容，使NaIO4終濃度為15 mM，在4℃暗處攪拌。于4，8，12……24，48 h間隔時間分別吸取反應(yīng)液0.1 mL，蒸餾水稀釋250倍后，以蒸餾水為對照在223 nm處測其光密度值，直至高碘酸的消耗量達到穩(wěn)定。用0.015 mol·L-1的NaIO4和0.015 mol·L-1碘酸鈉（NaIO3）稀釋250倍后的光密度值作標準。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)液5 mL于錐形瓶中加1 mL乙二醇攪拌30 min以終止反應(yīng)，加入幾滴酚酞，用0.01 N的NaOH滴定釋放的甲酸量。

1.3.7 DPPH自由基清除活性 用無水乙醇配制0.1 mmol·L-1的DPPH溶液，避光保存。配制0.5 mg·mL-1的Vc溶液（作為對照）。將測試樣品梯度稀釋。將2 mL待測樣品溶液和2 mL DPPH溶液加入到同一試管中，充分搖勻，室溫下避光靜置30 min后測定其吸光度i，同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混合后的吸光度，以及2 mL測試樣品與2 mL無水乙醇混合后的吸光度。自由基清除能力的表示為：

2 結(jié)果與分析

2.1 大苞鞘石斛多糖的分離純化

將多糖溶液通過DEAE-纖維素柱，得到44管分離溶液。用苯酚-硫酸法測定其多糖含量，繪制曲線圖1。從圖1可以看出，第6管中多糖含量最高，且只有1個吸收峰，說明大苞鞘石斛的多糖只有1種。對第3至第16管進行收集，濃縮透析，冷凍干燥，得到0.809 6g多糖。

圖1 DWW-1的DEAE-纖維素柱層析曲線

Figure 1 DWW-1 content determined by DEAE-cellulose chromatogram

2.2 單糖組成分析

對DDW-1和對照品HPLC的測定結(jié)果見圖2、圖3和表1。由圖表可知，主要出現(xiàn)4個峰，分別為葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GalUA）和巖藻糖（Fuc），其中甘露糖的含量為82.06%，葡萄糖為15.42%，葡萄糖醛酸為0.81%和巖藻糖為1.72%。因此，大苞鞘石斛的多糖中單糖的組成比例：Man:Glc:GlcUA:Fuc =101.3:19:1:2.1。

圖2 單糖標準品的HPLC曲線

Figure 2 Monosaccharides in the control by HPLC

圖3 樣品單糖的HPLC曲線

Figure 3 Monosaccharides from DWW-1 by HPLC

表1 樣品HPLC結(jié)果

2.3 純度分析及分子量測定

如圖4所示，DDW-1的峰出現(xiàn)在第10 min至第18 min之間，90°光散射和示差檢測器RI所產(chǎn)生的峰形具有相似大小和形狀，幾乎完全重疊，并且顯示多糖呈現(xiàn)單一對稱峰，因此DWW-1為均一性的純多糖。同時，測得DWW-1多糖純度達到99.82%。此外，Mw/Mn表示樣品的分散度，分子量分布越寬，分散度就越大[14]。測得Mw/Mn值為1.178，比較接近1，表明DWW-1是一個低分散度的多糖，其分子量Mw=6.479×104。

圖4 DWW-1的SEC-MALLS尺寸排阻色譜圖

Figure 4 SEC chromatogram of DWW-1 detected by SEC-MALLS

2.4 紅外光譜分析

DWW-1在400 ~ 4 000 cm-1區(qū)具有多糖類物質(zhì)的一般特征（圖5）。在3 430 cm-1附近的強吸收峰是糖分子中羥基的伸縮振動吸收峰；2 928 cm-1附近的吸收峰是C-H的伸縮振動峰；在1 735 cm-1，1 637 cm-1，1 382 cm-1，1 248 cm-1，1 028 cm-1，1 730 cm-1附近有糖醛酸的特征吸收峰，表明該多糖中可能存在有糖醛酸，這一測定結(jié)果與單糖衍生化的結(jié)果相一致，表明該多糖是酸性多糖。

圖5 DWW-1的紅外圖譜

Figure 5 Infrared spectrogram of DWW-1

2.5 高碘酸氧化反應(yīng)

根據(jù)實驗結(jié)果，經(jīng)過108 h后高碘酸氧化最終吸光度穩(wěn)定在0.556。由NaIO4標準曲線可知，高碘酸的總消耗量為0.188 5 mmol，甲酸的總釋放量為0.023 2 mmol。

通過標準曲線，平均0.1 mol己糖殘基（每個己糖殘基的分子量以162計算）消耗0.018 85 mol高碘酸，同時有0.002 32 mol的甲酸產(chǎn)生。己糖殘基、消耗的高碘酸鈉和生成的甲酸之間的摩爾比為1:0.188 5:0.023 2。由此推算，多糖中以1→6鍵相連的殘基或非還原末端基1→5占2.32%，可被高碘酸氧化，以不產(chǎn)生甲酸的1→2或1→4鍵相連的殘基占14.21%，不被高碘酸氧化的1→3鍵連接的殘基占83.47%。

2.6 抗氧化活性

通過實驗，800 μg·mL-1Vc的自由基清除率為98.31%，符合實驗的要求。由圖6所示，石斛多糖的抗氧化活性隨濃度的增加逐漸增強。但是，由于實驗中的多糖是通過水提醇沉的方法得到的，乙醇對其有一定的沉淀作用。故而當(dāng)多糖溶液達到一定的濃度時，有部分多糖會沉淀，從而影響實驗的進行，導(dǎo)致自由基清除率降低。

圖6 DWW-1自由基清除率

Figure 6 Hydroxyl radical scavenging rate of DWW-1

從圖6可以看出，石斛多糖的自由基清除能力隨多糖濃度的增加逐漸增強，在多糖濃度為650 μg·mL-1時，自由基的清除率最高達44.5%，根據(jù)鮑素華的鐵皮石斛多糖體外抗氧活性的研究中四種石斛多糖的抗氧化活性[15]，大苞鞘石斛多糖DWW-1的抗氧化能力較強，并且對劑量有較為明顯的依賴性。

3 結(jié)論與討論

大苞鞘石斛采用水提醇沉方法提取多糖，采用Sevag法對提取的粗多糖進行初步處理，除去游離的蛋白質(zhì)，處理后的粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱洗脫得到1種多糖DWW-1。通過PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化-HPLC法測定石斛多糖的單糖組成，可以得出多糖DWW-1主要由甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖構(gòu)成。其中甘露糖的含量為82.06%，葡萄糖為15.42%，葡萄糖醛酸為0.81%和巖藻糖為1.72%。在對大苞鞘石斛多糖DWW-1的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)通過高碘酸氧化和紅外光譜檢測進行分析，初步了解了多糖DWW-1的分子結(jié)構(gòu)特征及其抗氧化活性。這一單糖組成與目前發(fā)現(xiàn)的石斛屬其他單一多糖結(jié)構(gòu)上有很大差別，如金釵石斛LindlDNP-W1B由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖3種單糖組成，摩爾比為6.2:3.1:0.9[16]。與藥用鐵皮石斛原球莖多糖D-02C[17]，DCPP1a-1[18]，DCPP3c-1[19]在結(jié)構(gòu)和組成上也有很大不同，這說明此次發(fā)現(xiàn)的大苞鞘石斛多糖在功能活性上與之前發(fā)現(xiàn)的多糖有差異，因此其生物學(xué)活性有待于進一步的深入研究。

[1] Fan W W，Xu F Q，Dong F W，.A and B, two new sesquiterpenoids fromWarner[J]. Tetrahedron Lett，2013，54：1928－1930.

[2] 陳娜，方炎明，程磊. 大苞鞘石斛種子萌發(fā)過程中形態(tài)變化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：1038－1040.

[3] 王偉. 大苞鞘石斛（）離體培養(yǎng)與快速繁殖的研究[D]. 杭州：浙江林學(xué)院，2009.

[4] 吳元玲，申曉輝. 大苞鞘石斛原球莖玻璃化超低溫保存技術(shù)的研究[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2011，33（3）：279－287.

[5] 黃民權(quán)，黃步漢，蔡體育. 鐵皮石斛多糖的提取、分離和分析[J]. 中草藥，1994，25（3）：128.

[6] 趙永靈，王世林，李曉玉. 兜唇石斛多糖的研究[J]. 云南植物研究，1994，16（4）：392.

[7] 陳云龍，張銘，華允芬，等. 細莖石斛不同部位有效成分及分布規(guī)律研究[J]. 中國中藥雜志，2001，26（10）：709.

[8] 徐程，陳云龍，張銘. 細莖石斛多糖DMP2a-1的結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國中藥雜志，2004，39（12）：900.

[9] 陳璋輝，陳云龍，吳濤，等. 細莖石解多糖DMP4a-1的結(jié)構(gòu)特性及免疫活性研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2005，40（23）：1781.

[10] 章金輝，王再花，李杰，等. 大苞鞘石斛與鐵皮石斛主要活性成分比較分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，2015，36（12）：2192－2197.

[11] 李安華，周志宏，沈妍，等. 大苞鞘石斛化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012（24）：479－480.

[12] Staub A M. Removal of protein-Sevag method[J]. Methods Carbohydr Chem，1965，5：5－6.

[13] 邵雙雙，賀亮，韋朝陽，等. 新型中國被毛孢胞內(nèi)多糖HSIPS2鏈構(gòu)象及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37（04）：200－227.

[14] 張森，劉平懷，王麗波，等. 氮對纖維藻生長、油脂積累及營養(yǎng)吸收的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（01）：155－159.

[15] 鮑素華. 鐵皮石斛多糖抗氧活性的研究[D]. 合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2009.

[16] 王軍輝，查學(xué)強，潘利華，等. 金釵石斛免疫活性多糖 DNP-W1B的結(jié)構(gòu)特征[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2013，34（4）：881－885.

[17] 林宏，施松善，王順春. 鐵皮石斛原球莖多糖D-02C的結(jié)構(gòu)特征及其抗補體活性[J]. 福建中醫(yī)藥，2012，43（3）：54－57.

[18] 何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等. 鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19：578－583.

[19] 何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等. 鐵皮石斛原球莖多糖DCPP3c-1的分離純化及結(jié)構(gòu)初步分析[J]. 分析測試學(xué)報，2008，27（2）：143－147.

Purification and Analysis of DWW-1 from

QIN Yu-chuan，WANG Li-ling，WANG Yan-bin，HE Liang，LIU Ben-tong，QIAN Hua，TONG Xiao-qing

（Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China）

Crude polysaccharides fromwere extracted by water and precipitated by ethanol. Deproteinization with Sevage method, DWW-1 was separated and purified by DEAE-Cellulose and Sephadex G-75 column chromatography. Analysis of properties and structure was performed by using chemical method, HPGPC, HPLC, GC-MS and IR. The results showed that DWW-1 was a white flocculent solid after vacuum freeze-drying, soluble in water, with relative molecular mass of 6.479×104. It was composed of glucose, glucuronic acid, mannose and fucose. DWW-1 showed strong scavenging ability on DPPH free radicals.

; polysaccharide; isolation; physicochemical properties; structure analysis

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.04.003

S567.5

A

1001-3776（2018）04-0015-06

2017-12-11；

2018-03-05

浙江省科技計劃項目：觀賞用石斛水培關(guān)鍵技術(shù)研究與示范（2014F50020）

秦玉川，工程師，從事動植物保護與利用工作；E-mail：hzqinchuan@126.com。

童曉青，副研究員，從事藥用植物栽培工作；E-mail：81918735@qq.com。