余永婷，房磊，史萬禮，郭焰，謝瓊

（1.新疆輕工職業(yè)技術學院，新疆烏魯木齊830000；2.吉林大學，吉林長春130000；3.新疆大學，新疆烏魯木齊830000）

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物[1]，同扁桃、腰果、榛子并列稱為世界四大干果[2]，新疆的主要林果之一，主產(chǎn)區(qū)集中在新疆、甘肅、陜西等中西部地區(qū)[3-5]，畝產(chǎn)量最高可達400 kg[6]。核桃中除了富含大量的油脂、糖類化合物、礦物質、維生素、磷脂等成分[7]外，還含有15%～25%[8-9]的蛋白質，且氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸配備合理[10-11]，符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）規(guī)定的要求，核桃蛋白能夠補血、潤肺、養(yǎng)神等，具有重要的生理保健作用[12]。

核桃蛋白不僅氨基酸的種類豐富而且具有生理功能等特性，被視為是一種價值較高的蛋白質資源，所以備受人們關注，目前核桃主要用來提取油脂或以干果形式進行銷售食用[13-14]，加工產(chǎn)品簡單，對核桃蛋白的提取主要有堿溶酸沉法、酶解法、超聲波輔助等方法，超聲波-微波輔助方法是將超聲波技術和微波技術相結合進行提取的一種新型方法，不僅能夠縮短提取時間而且極大地提高了蛋白提取率[15]，廣泛的應用在油脂、蛋白、多糖等物質的提取與制備方面[16-17]。因此本文采用超聲波-微波協(xié)同輔助法對核桃蛋白進行提取，并采用正交試驗進一步優(yōu)化出最佳提取工藝，對其等電點進行測定，為核桃蛋白的精深加工奠定了良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

核桃：市售；濃硫酸、鹽酸、乙酸、固體氫氧化鈉、對硝基苯酚、溴化鉀、甲醛、乙酰丙酮、硫酸銨、硫酸銅（均為分析純）：北京化工廠。

HYP-320型智能消化爐：上海纖檢儀器有限公司；FA1004A型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；UWave-1000型微波-紫外-超聲波三位一體合成萃取反應儀：上海新儀微波化學科技有限公司；RHP-350型高速多功能粉碎機：浙江容浩工貿(mào)有限公司；PHS-3D型PH計：上海精密科學儀器有限公司；CT15RT型臺式高速冷凍離心機：上海天美科學儀器有限公司；Alpha1-4LP Plus型凍干機：德國有限公司；TU-1901型紫外分光光度計：北京普希通用儀器有限責任公司；HSC-3型差示掃描量熱儀：北京恒久科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程及核桃蛋白提取率的計算

核桃蛋白含量及純度的測定參考GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的分光光度法，提取率及蛋白純度計算見公式所示[18]。

1.2.2 核桃蛋白提取單因素試驗

選取料液比（g/mL）、pH 值、超聲功率（W）、微波功率（W）4個單因素進行考察[19-20]，設定料液比 1∶10、1 ∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），pH 值8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，超聲波功率 300、350、400、450、500 W，微波功率100、150、200、250、300 W，3 次平行試驗取均值[21-22]。固定的單因素：核桃仁粉 100.00 g、料液比 1 ∶15（g/mL）、pH9.0、超聲波功率400 W、微波功率200 W。以核桃蛋白質的提取率作為評價指標。

1.2.3 核桃蛋白提取正交試驗

核桃蛋白提取正交試驗見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3 核桃蛋白功能特性的測定

1.3.1 等電點的測定

將3.0 g凍干后的核桃蛋白粉末，溶解在200 mL的蒸餾水中，調(diào)至pH10.0，核桃蛋白充分溶解，0.1 mol/L的 HCl溶液調(diào)節(jié) pH 值至 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，邊加HCl溶液邊攪拌，靜置30 min，使溶液中的蛋白沉淀完全，3 800 r/min離心15 min，棄沉淀取上清2 mL，用移液管吸取8 mL雙縮脲試劑，混合均勻，30 min后540 nm波長處測吸光度，吸光值的大小反應了蛋白沉淀量多少，蛋白沉淀越多吸光值越小，即此時pH值就為核桃蛋白質的等電點[23-24]。

1.3.2 溶解度的測定

分別在不同蛋白濃度、不同pH值、不同溫度條件下對核桃蛋白溶解度進行測定，配制濃度：10、15、20、25、30 mg/mL 的蛋白溶液；pH 值：3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的蛋白溶液；溫度：40、50、60、70、80 ℃；攪拌 30 min，核桃蛋白充分溶解，3 800 r/min離心20 min，采用雙縮脲法測離心后溶液中的蛋白含量[25]。

1.3.3 核桃蛋白變性溫度的測定

電子天平稱取10 mg核桃蛋白，放入坩堝中，對照組：空白，溫度：30℃～500℃，以速度10℃/min升溫，記錄吸熱曲線，繪制差式掃描量熱掃描曲線[26-28（]differential scanning calorimetry，DSC）。圖像最低點即為蛋白的變性溫度。

2 結果分析

2.1 核桃蛋白提取單因素結果

2.1.1 料液比對蛋白提取率的影響

料液比對蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 料液比與提取率之間的關系Fig.1 The relationship between the ratio of material to liquid and extraction rate

由圖 1 可知，料液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）范圍內(nèi)變化時，提取率不斷增大，料液比在1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL）范圍內(nèi)變化，提取率下降并保持平穩(wěn)狀態(tài)，料液比在1∶20（g/mL）時，提取率最大。提取液用量增加有助于蛋白質從內(nèi)部溶出從而提取率變大。當?shù)鞍踪|溶出飽和，增加提取液而提取率不在上升。因此選取料液比 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）進行正交試驗。

2.1.2 pH值對蛋白提取率的影響

pH值對蛋白提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當提取液pH值在8.5～10.5范圍內(nèi)變化時，核桃蛋白提取率隨著提取液pH值的不斷增大先上升后下降，pH 9.0時提取率出現(xiàn)峰值。蛋白是堿溶性的，適當?shù)膒H值有助于蛋白質溶出，pH值過大，導致蛋白質內(nèi)部的可解離基團因受強烈的靜電排斥作用造成分子伸展，蛋白質變性沉淀，提取率降低。因此選pH 8.5、9.0、9.5進行正交試驗。

圖2 pH值與提取率之間的關系Fig.2 Relationship between pH and extraction rate

2.1.3 超聲波功率對蛋白提取的影響

超聲波功率對蛋白提取的影響見圖3。

圖3 超聲功率與提取率之間的關系Fig.3 Relationship between ultrasonic power and extraction rate

由圖3可知，超聲功率在300 W～500 W范圍內(nèi)變化時，提取率隨著超聲波功率增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，功率400 W時提取率最大，超聲波的空化效應會使細胞壁破壞完全在提取中具有輔助作用，提高蛋白質溶出率，提取率上升，但是功率過大，會破壞蛋白中氫鍵，破壞蛋白結構，蛋白沉淀在細胞內(nèi)，從而提取率下降。因此選350、400、450 W進行正交試驗。

2.1.4 微波功率對蛋白提取率的影響

微波功率對蛋白提取率的影響見圖4。

微波功率在100 W～300 W之間內(nèi)變化時，提取率曲線呈先上升后下降趨勢，150 W時提取效果最佳。微波具有破壞細胞壁加速蛋白質溶出的作用，從而提高了提取率，微波提取過程中會產(chǎn)生大量熱量，微波功率過大，溫度上升會使蛋白中的氫鍵斷開，蛋白因高溫變性，沉淀在細胞內(nèi)無法溶出，從而提取率下降。所以選微波功率100、150、200 W進行正交試驗。

圖4 微波功率對提取率的影響Fig.4 The effect of microwave power on the extraction rate

2.1.5 核桃蛋白提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，按L9（34）設計正交試驗，優(yōu)化最佳提取參數(shù)，試驗結果見表2，正交試驗的方差分析見表3。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design matrix and results

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表2正交試驗顯示結果可知，超聲波-微波輔助提取對核桃蛋白提取率的影響程度分別為超聲波功率＞pH值＞料液比＞微波功率，最佳提取工藝為A2B2C2D3，即料液比 1∶20（g/mL）、pH9.0、超聲波功率400 W、微波功率200 W，該試驗組不在正交試表中，需進行驗證試驗，驗證結果為：最大提取率（93.48±1.02）%。

由表3 spss軟件結果顯示，校正模型具有顯著性，A、B、C、D 各因素的影響值 P＜0.01，表明上述 4個因素在提取過程中可作為影響提取率的首要考慮因素。

2.2 核桃蛋白功能特性測定結果

2.2.1 核桃蛋白等電點測定

等電點示意圖見圖5。

圖5 等電點示意圖Fig.5 Schematic view of the isoelectric point

由圖5可知，pH值在3.5～6.0之間變化，吸光值先下降后上升，pH 5.0時吸光度最小。說明在pH 5.0時溶液中的蛋白質沉淀量最大，此時處于等電點，分子所帶的靜電荷為0，溶解性最差。

2.2.2 核桃蛋白濃度對溶解度影響

核桃蛋白濃度對溶解度影響見圖6。

圖6 蛋白濃度對溶解度的影響Fig.6 Effect of protein concentrations on solubility

由圖6可知，核桃蛋白在由10 mg/mL增加到30 mg/mL，蛋白的溶解度先上升出現(xiàn)最大值，然后呈現(xiàn)下降趨勢，在20 mg/mL時出現(xiàn)最大值，由于適當?shù)脑黾拥鞍诐舛扔兄诘鞍椎某浞秩芙猓鞍诐舛冗^大，水分子被蛋白吸收形成過飽和溶液，導致溶解不完全，所以溶解度下降。

2.2.3 pH值對核桃蛋白溶解度的影響

pH值對核桃蛋白溶解度的影響見圖7。

圖7 pH值對溶解度影響Fig.7 Effect of pH on solubility

由圖7可知，溶液pH值由3.0到11.0范圍內(nèi)變化，溶解度在pH 5.0時最低，由于處于核桃蛋白的等電點，隨著pH值的繼續(xù)增大，溶解度逐漸上升出現(xiàn)最大值并趨于平穩(wěn)，因為蛋白質易溶于堿性環(huán)境，且有最佳溶解pH值，而難溶于酸性環(huán)境。

2.2.4 溫度對核桃蛋白溶解度的影響

溫度對核桃蛋白溶解度的影響見圖8。

圖8 溫度對溶解度影響Fig.8 Effect of temperature on solubility

由圖8的試驗結果可知，溶解度隨著溫度變化，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在溫度70℃時，溶解性最好，溫度適當增加有利于蛋白分子伸展，吸收更多水分形成水合分子，故而溶解性較好，但溫度過高導致蛋白分子的天然結構破壞，分子松散，吸水性下降，溶解性降低。

2.2.5 核桃蛋白變性溫度測定

核桃蛋白DSC掃描結果見圖9。

由圖9可知，核桃蛋白在加熱過程中呈現(xiàn)先吸熱后放熱的狀態(tài)，在DSC曲上有一個明顯的最低峰，即核桃蛋白的最大熱量吸收峰，峰頂所對應的溫度83.80℃即為蛋白的變性溫度，溫度高于83.80℃后，蛋白質天然結構逐漸破壞崩塌，蛋白變性[29]。蛋白的對熱穩(wěn)性較好，這也解釋了在接近80℃溶解度下降的原因。

圖9DSC掃描結果Fig.9 The results of differential scanning calorimeter scanning

3 結論

本試驗采用超聲波-微波輔助法提取核桃蛋白，選取料液比、pH值、超聲波功率、微波功率為考察因素，通過單因素試驗結合正交試驗，得到出最佳提取工藝參數(shù)：料液比 1 ∶20（g/mL）、pH 9.0、超聲波功率400 W、微波功率200 W，此條件下蛋白提取率最大為（93.48±1.02）%。

對核桃蛋白等電點測定結果顯示核桃蛋白等電點為pH 5.0，濃度在20 mg/mL時溶解度最大，最佳溶解溫度為70℃，在蛋白等電點附近溶解度最差，且隨著pH值的不斷增大溶解度不斷升高，差示熱量測量結果顯示，核桃蛋白的在83.80℃時有一個明顯的向下吸收峰，即核桃蛋白的變性溫度。