侯婷婷，侯 惺，李 遠(yuǎn)，李 鈿，索海燕,周 正

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)部，濟(jì)南 250001；2.山東省棗莊市立醫(yī)院藥房，山東棗莊 277100； 3.山東省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250013)

中國的結(jié)核病發(fā)病率位居全球第二，結(jié)核病患者人數(shù)僅次于印度[1]。脊柱結(jié)核是結(jié)核病中的重要類型之一，占結(jié)核病總患者的2%～5%[2]，并且脊柱結(jié)核約占人類骨結(jié)核的50%[3]。在中國、印度等發(fā)展中國家中，20歲以下人群為易感人群，在發(fā)達(dá)國家，則反之[3]，并且發(fā)展中國家的男性發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性。傳統(tǒng)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)一般為結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)，然而，傳統(tǒng)試驗(yàn)方法存在較多弊端，例如抗酸染色法陽性率偏低，MTB培養(yǎng)周期較長，需3～7周，而且對MTB的質(zhì)量要求較高，因而，急需一種能快速準(zhǔn)確檢測MTB感染的方法。GeneXpert MTB/RIF作為一種快速、有效的分子診斷手段，得到世界衛(wèi)生組織的認(rèn)可和推薦。GeneXpert MTB/RIF可在2 h內(nèi)直接從痰液標(biāo)本中檢測MTB和利福平(RIF)耐藥性，其靈敏度為67%～96%，特異度為95%[4-5]。本研究通過脊柱組織標(biāo)本檢測，評價(jià)了GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核患者中的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月至2016年12月山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院收治的經(jīng)臨床表現(xiàn)、病理學(xué)檢查和影像學(xué)檢查確診的脊柱結(jié)核患者共192例納入病例組，其中男100例(52.08%)，女92例(47.92%)；<20、20～<40、40～<60、≥60歲患者分別為16例(8.33%)、66例(34.37%)、76例(39.58%)、34例(17.70%)；病變部位包括頸椎、胸椎、腰椎、骶椎分別12例(6.25%)、72例(37.50%)、100例(52.08%)、8例(4.17%)；主要癥狀包括咳嗽、咳痰、發(fā)熱、咯血、胸痛、血液傳播、繼發(fā)性肺結(jié)核分別23例(11.97%)、33例(17.18%)、35例(18.22%)、18例(9.37%)、31例(16.14%)、2例(1.04%)、50例(26.04%)。選取50例健康體檢者納入對照組，結(jié)核抗體和胸片檢查均為陰性，排除結(jié)核病，其中男37例，女13例，年齡15～61歲，平均(39.3±7.7)歲。

1.2方法 所有研究對象標(biāo)本采集前未使用過抗結(jié)核藥物治療。對術(shù)中所獲取的脊椎組織，使用高速粉碎機(jī)進(jìn)行充分的粉碎研磨，加入NaOH和磷酸鹽緩沖液，在高速振蕩儀中振蕩，并在高速離心機(jī)中以15 000 r/min離心15 min，離心后的沉淀物分成3份待用,分別進(jìn)行熒光抗酸涂片染色法檢測、BACTECT MGIT 960(BD公司)MTB培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測。

1.2.1熒光抗酸涂片染色法 按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]中的要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。報(bào)告方式按照100倍物鏡按1+～4+進(jìn)行分級(jí)。

1.2.2MGIT960 MTB液體培養(yǎng)及RIF靈敏度試驗(yàn) 取沉淀物1 mL置于添加營養(yǎng)劑和雜菌抑制劑的MGIT960液體培養(yǎng)管中，放于BACTECT MGIT960培養(yǎng)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中對陽性標(biāo)本進(jìn)行RIF(1 μg/mL)藥敏試驗(yàn)。

1.2.3GeneXpert MTB/RIF檢測 取1.5 mL沉淀物加入2 mL處理液中，并置于高速渦旋振蕩器上混勻，孵育15 min取處理液加入反應(yīng)盒后，置于GeneXpert檢測模塊中，2 h后判讀結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以臨床診斷和MTB液體藥敏法為金標(biāo)準(zhǔn)，通過計(jì)算靈敏度、特異度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值及其95%置信區(qū)間，評價(jià)GeneXpert MTB/RIF檢出MTB及RIF耐藥性的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核診斷中的應(yīng)用 192例脊柱結(jié)核患者病灶標(biāo)本中，155例GeneXpert MTB/RIF結(jié)果陽性，37例陰性。以臨床診斷影像學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，熒光抗酸涂片染色法、MGIT960 MTB液體培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF在檢測脊柱結(jié)核方面的靈敏度分別為26.56%、58.33%和80.72%，見表1。

表1 3種方法檢測脊柱結(jié)核的診斷性能

2.2GeneXpert MTB/RIF在檢測RIF耐藥性方面的應(yīng)用 本試驗(yàn)以MGIT960 MTB液體藥敏法為金標(biāo)準(zhǔn)，利用GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)對192例患者和50例健康對照者標(biāo)本進(jìn)行RIF耐藥檢測，結(jié)果顯示MGIT960 MTB液體藥敏法檢測出對RIF敏感189例，耐藥53例，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)檢出對RIF敏感185例，耐藥57例，2種方法均檢測對RIF敏感的為179例，耐藥47例。因而，GeneXpert MTB/RIF在檢測RIF耐藥方面的靈敏度為94.70%，特異度為88.67%，陽性預(yù)測值為96.75%，陰性預(yù)測值為82.45%。

3 討 論

2017年WHO對全球結(jié)核病控制的重點(diǎn)是快速準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病，尤其是提高耐多藥結(jié)核的診斷能力。結(jié)核病的早期診斷及其耐藥性的檢測，對于很好地控制耐藥結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義。近年來我國結(jié)核病患者數(shù)量大大降低，然而脊柱結(jié)核病患者比例逐年升高，現(xiàn)已占國內(nèi)總結(jié)核感染人數(shù)的22%[7]，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室使用的固體MTB培養(yǎng)和普通抗酸染色涂片方法靈敏度較低(<48%)[8]，又由于脊柱結(jié)核標(biāo)本的特殊性，在實(shí)驗(yàn)室操作和檢測時(shí)，較難從脊柱組織標(biāo)本中分離MTB，導(dǎo)致較高的假陰性率，從而會(huì)出現(xiàn)臨床診斷的延誤。因此，在脊柱結(jié)核臨床診療中急需一種快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，近年來，分子診斷技術(shù)檢測MTB中的DNA可提高試驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性[9]。GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)以半巢式實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)檢測MTB中rpoB基因，檢測周期為2 h左右，并且可以檢測RIF的耐藥性[10]。本研究使用脊柱組織標(biāo)本，評估GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)快速準(zhǔn)確診斷脊柱結(jié)核的應(yīng)用價(jià)值。

本研究使用GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測脊柱結(jié)核的靈敏度為80.72%、特異度為92.00%，檢測RIF耐藥性的靈敏度為94.70%，特異度為88.67%。然而李力韜等[11]用GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測脊柱結(jié)核患者的靈敏度和特異度均達(dá)到98%以上，均高于本研究中結(jié)果。本研究結(jié)果較低的原因有以下幾點(diǎn)，首先，李力韜等[11]的研究中標(biāo)本來源均使用MTB培養(yǎng)陽性的標(biāo)本，而本研究中標(biāo)本直接來源于臨床手術(shù)標(biāo)本，未使用細(xì)菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本。其次，國外學(xué)者ARMAND等[12]的研究中，對同一脊柱標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)多次結(jié)果平均值得出最終結(jié)果，其靈敏度和特異度均高于單次試驗(yàn)結(jié)果，而本研究對每份標(biāo)本只檢測一次。由此可見GeneXpert MTB/RIF 檢測次數(shù)的增加會(huì)提高其檢測MTB的靈敏度和特異度[13]。由于本試驗(yàn)標(biāo)本量較少，并且病例中含有較多兒童病例，有國外文獻(xiàn)報(bào)道，GeneXpert MTB/RIF檢測兒童結(jié)核患者時(shí)，其靈敏度和特異度明顯低于成人，因此較多的兒童病例會(huì)降低本研究的靈敏度和特異度[14]。

國外文獻(xiàn)報(bào)道MGIT960 MTB液體培養(yǎng)法無法培養(yǎng)非MTB，但由于非MTB會(huì)引起病變與MTB相似的臨床癥狀，臨床上易被誤診為結(jié)核感染。MCNERNEY等[15]報(bào)道，對已知的11株非MTB進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測，檢出11株非MTB，GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果均為陰性反應(yīng)，特異度達(dá)100.00%。在本次研究中未檢出非MTB的標(biāo)本，原因可能為：非MTB通常感染部位是肺部組織、淋巴結(jié)、終末支氣管、皮膚及特殊軟組織。另由于本研究收集組織標(biāo)本量較少，沒有足夠量標(biāo)本來分析非MTB在脊柱組織中的感染情況。因此，在日常臨床工作中，對于GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果為陰性的患者，臨床醫(yī)師也需要根據(jù)影像學(xué)診斷及其他檢測方法，客觀分析患者病情。

MTB感染患者中有一部分為血液播散性的病例，患者病情十分兇險(xiǎn)，但是國內(nèi)外研究中，并沒有納入血液播散性病例，在未來的研究中，將進(jìn)一步納入血液播散性病例。本研究由于使用的標(biāo)本類型為脊柱病灶組織，標(biāo)本數(shù)量較少，標(biāo)本類型單一，不能全面、綜合地評價(jià)GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)在不同類型標(biāo)本診斷結(jié)核感染中的診斷價(jià)值，在下一步研究中，盡量多收集不同標(biāo)本類型的標(biāo)本，例如胸腔積液、肺泡灌洗液、關(guān)節(jié)液等。因此，還需要更多實(shí)驗(yàn)報(bào)告來評價(jià)GeneXpert MTB/RIF在快速診斷病情危重結(jié)核患者的價(jià)值 。