楊秀蓮

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東惠州 516000

稽留流產(chǎn)是妊娠20周內(nèi)胚胎或胎兒已死亡而未排出母體[1]。發(fā)生原因多種多樣，包括遺傳、感染、環(huán)境、免疫等因素[2-3],但具體機(jī)制不詳。一些研究越來越重視感染及細(xì)胞凋亡因素，其可能是導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的重要因素。多項(xiàng)研究也證實(shí)了Toll樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB（NF-κB）與感染及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。TLR4、NF-κB通過各種機(jī)制參與自然流產(chǎn)的發(fā)生及發(fā)展，但兩者與稽留流產(chǎn)的相關(guān)研究甚少。本研究采用免疫組化法檢測TLR4、NF-κB稽留流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)，探討兩者與稽留流產(chǎn)的關(guān)系，為進(jìn)一步探討稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2017年10月在惠州市第三人民醫(yī)院婦科收治的90例稽留流產(chǎn)患者作為實(shí)驗(yàn)組，其中50例稽留流產(chǎn)伴感染者作為A組，40例稽留流產(chǎn)伴不伴感染者作為B組。A組年齡20～35歲，平均（26.3±2.4）歲；孕齡 7～12 周，平均（9.5±1.5）周；B組年齡 20～36 歲，平均（26.3±2.5）歲；孕齡 7～13 周，平均（9.6±1.5）周。選取同期無合并癥并要求行人工流產(chǎn)的50例早孕婦女作為對照組（C組），年齡23～35歲，平均（27.1±2.5）歲；孕齡 6～10 周，平均（7.5±1.5）周。三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。各組夫妻雙方染色體核型正常，男方精液正常，實(shí)驗(yàn)組既往無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，無免疫系統(tǒng)異常，無產(chǎn)道異常及遺傳病史，平素月經(jīng)周期規(guī)律，在流產(chǎn)前無用藥史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與研究者均簽署知情同意書。稽留流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)以人民衛(wèi)生出版社第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》為主。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源 所有病例經(jīng)負(fù)壓吸引術(shù)后取其絨毛及蛻膜組織，用0.9%生活鹽水沖洗干凈，用4%多聚甲醛固定后送病理科常規(guī)包埋石蠟切片。

1.2.2 免疫組織化學(xué) SP法檢測使用的兔抗人TLR4抗體、鼠抗人NF-κB抗體及通用型免疫組化試劑盒均購于北京中杉生物科技公司。按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)與評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 HE結(jié)果判讀 顯微鏡下觀察絨毛組織無水腫，滋養(yǎng)細(xì)胞無明顯增生。

1.3.2 免疫組化染色片的閱讀 以細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，其著色強(qiáng)度高于非特異性背景者為判斷陽性。根據(jù)染色深淺及陽性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行處理。染色深淺評分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞無顯色或顯色不清為0分，細(xì)胞呈淺黃色為1分，細(xì)胞呈棕黃色為2分，細(xì)胞呈棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：＜10%為 0分，10%～50%為 2分，＞50%～80%為 3分，＞80%為4分。將上述兩項(xiàng)評分相加0～1分定為陰性（-）；2～3 分為陽性（+）；4～5 分為中等陽性（++）；6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用χ2檢驗(yàn)、Fishem確切概率法檢驗(yàn)及Spearman等級相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4、NF-κB在絨毛和蛻膜組織的表達(dá)

A、B組及C組的絨毛及蛻膜組織中均可見TLR4、NF-κB表達(dá)。其中絨毛組織中TLR4主要表達(dá)在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及合體滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中，在蛻膜組織中表達(dá)于腺體上皮細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜。NF-κB在絨毛的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，蛻膜組織主要表達(dá)在腺體上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。 A、B組與 C組比較，TLR4、NF-κB在 A、B組的絨毛及蛻膜組織中表達(dá)均增高（表1）；與B組比較，TLR4在A組的絨毛及蛻膜組織中表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表1 TLR4、NF-κB在三組絨毛組織的表達(dá)情況的比較[n（%）]

表2 TLR4在A、B組絨毛組織中表達(dá)情況的比較（例）

2.2 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，A組的TLR4及NF-κB在絨毛及蛻膜組織中表達(dá)成正相關(guān)（r=0.527，χ2=9.56，P＜0.05）（表3）。

表3 A組的TLR4、NF-κB表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

3.1 TLR4與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性

TLR4廣泛分布在人體組織中，其與相應(yīng)的配體結(jié)合后，通過各種信號傳導(dǎo)通路激活細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答以及多種炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)。低濃度的TNF-α可以維持妊娠正常進(jìn)行，而高濃度的TNF-α可通過以下機(jī)制導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生：①促進(jìn)前列腺素E的合成，進(jìn)而興奮子宮平滑肌；②促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞大量凋亡；③激發(fā)Thl型免疫反應(yīng)，排斥胚胎組織。TLR4與流產(chǎn)關(guān)系密切，張?jiān)律彽萚5]研究顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與外周血淋巴細(xì)胞、絨毛及蛻膜組織中TLR4高表達(dá)密切相關(guān),提示對早孕女性進(jìn)行外周血TLR4的監(jiān)測,有利于預(yù)測流產(chǎn)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Friebe等[6]在研究自然流產(chǎn)模型鼠中發(fā)現(xiàn),通過加入某些因素使TLR4的異常表達(dá)，激活了TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致大量炎性因子釋放，使母胎之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，而阻斷TLR4信號通路，能夠減少胎鼠的丟失，進(jìn)而減少流產(chǎn)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在稽留流產(chǎn)患者及正常早孕女性的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜組織中均有TLR4表達(dá)，但TLR4在稽留流產(chǎn)組表達(dá)強(qiáng)度明顯高于C組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且稽留流產(chǎn)患者中伴有炎癥細(xì)胞較多的絨毛組織中的TLR4表達(dá)強(qiáng)度明顯高于C組，提示TLR4與人類胚胎發(fā)育關(guān)系也較為密切；絨毛及蛻膜組織中TLR4的正常表達(dá)維持著正常妊娠過程；某些因素導(dǎo)致妊娠女性胚胎中絨毛及蛻膜組織中的TLR4表達(dá)增高，而高濃度的TLR4可能通過上述機(jī)制使胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡，繼而使胚胎發(fā)育停止，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)生。

3.2 NF-κB與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性

NF-κB在機(jī)體多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，其激活后對細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。如在感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中，NF-κB通過參與調(diào)節(jié)炎癥過程中細(xì)胞黏附因子和某些細(xì)胞因子的表達(dá)可能發(fā)揮著重要作用[7]。研究顯示，在妊娠女性子宮內(nèi)膜及蛻膜組織中均有NF-κB少量表達(dá)，低濃度的NF-κB可參與早期胚胎的發(fā)育及著床過程，而NF-κB的表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致妊娠過程不能繼續(xù)進(jìn)行。高濃度的NF-κB參與流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制如下。①調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶-2（COX-2）的合成和釋放，后者誘導(dǎo)前列腺素的產(chǎn)生后興奮子宮平滑肌，誘發(fā)子宮收縮；②引起胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡，加劇母胎之間的排斥反應(yīng)，間接誘發(fā)子宮收縮；③調(diào)節(jié)TNF-α的合成及釋放：高濃度的TNF-α一方面通過提高體內(nèi)前列腺素E的合成及激活凝血系統(tǒng)，興奮子宮平滑肌，促使胎盤滋養(yǎng)血管內(nèi)血栓形成，影響絨毛的正常發(fā)育；另一方面激發(fā)Thl型免疫反應(yīng)，排斥胚胎組織導(dǎo)致流產(chǎn)；④調(diào)節(jié)孕酮的表達(dá)水平，使孕酮與不能與相應(yīng)受體結(jié)合，不能抑制子宮收縮，繼而不能繼續(xù)維持妊娠[8]。多項(xiàng)研究顯示NF-κB與流產(chǎn)關(guān)系密切[9-11]。本研究結(jié)果顯示，在稽留流產(chǎn)組及正常早孕組的絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜腺上皮細(xì)胞中均有NF-κB表達(dá)，但在稽留流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜中的表達(dá)高于對照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示絨毛中正常水平的NF-κB可能參與人類早期胚胎發(fā)育及著床過程，維持正常妊娠過程；某些因素導(dǎo)致絨毛中NF-κB表達(dá)增高后可能通過上述機(jī)制則使滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，繼而胚胎發(fā)育停止，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)。

3.3 TLR4-NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與稽留流產(chǎn)的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，TLR是體內(nèi)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的模式識別受體，能夠識別多種病原微生物并啟動(dòng)下游信號通路，通過活化NF-κB來啟動(dòng)機(jī)體炎癥介質(zhì)的表達(dá)及激活局部組織的炎癥反應(yīng)[12]，故TLR4-NF-κB是與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)的一條信號傳導(dǎo)通路。TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過MyD88依賴性途徑來介導(dǎo)NF-κB及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而激發(fā)下游炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞內(nèi)TLR4與配體結(jié)合后募集MyD88，使MyD88與特異的接頭蛋白發(fā)生橋接，使TLR4把信號傳到細(xì)胞內(nèi)，通過激活一系列酶促使NF-κB入核后使相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄及翻譯，炎性因子大量釋放后參與炎癥反應(yīng)及組織器官的損傷[13]。多項(xiàng)研究顯示TLR4-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘[14]、心肌梗死[15]、糖尿病[16]、肺炎支原體感染[17]、骨關(guān)節(jié)炎[18]、潰瘍性結(jié)腸炎[19]等炎癥性疾病中起著重要作用。炎癥因素也是導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的原因之一。 白雪等[20]發(fā)現(xiàn) TLR4、NF-κB、p65 在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的絨毛組織中蛋白和mRNA表達(dá)水平有升高，推測TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生密切相關(guān)。本研究顯示，在同一稽留流產(chǎn)患者伴有炎癥的絨毛及蛻膜組織中TLR4與NF-κB表達(dá)成正相關(guān)，故推測在早期妊娠過程中某些因素如激活了TLR4一NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致體內(nèi)某些炎性因子大量釋放或細(xì)胞異常凋亡，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)生。