孫影 吳興饒 許志峰 夏敏 孔慶霞

大腦中的炎癥介質(zhì)在癲癇發(fā)生以及隨之而來(lái)的合并癥、癲癇的神經(jīng)病理學(xué)中起著病因?qū)W作用[1-2]。 而激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AST）具有吞噬功能，并能分泌多種炎性因子參與中樞神經(jīng)炎癥的發(fā)生[3]。粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）能夠透過(guò)血腦屏障[4]，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是否存在粒細(xì)胞集落刺激因子受體（granulocyte colony-stimulating factor receptor,GCSFR），G-CSF能否通過(guò)激活A(yù)ST上的 G-CSFR從而減輕癲癇導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)都尚未明確。因此，我們通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型建立由山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證scxk魯20140007)提供38只健康成年雄性C57BL／6小鼠，體重20～25 g，均為6～8周齡。動(dòng)物使用已通過(guò)山東大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型：C57BL／6小鼠稱重后腹腔注射溴化甲基阿托品(1 mg／kg,Sigma),30 min后腹腔注射匹羅卡品(300 mg／kg,Sigma)。根據(jù)改良Racine評(píng)分[5]（對(duì)小鼠發(fā)作程度進(jìn)行評(píng)估。將癲癇發(fā)作＞4級(jí)，且持續(xù)發(fā)作1 h的小鼠納入癲癇持續(xù)狀態(tài)模型組。小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)1 h 后，腹腔給予地西泮（7.5 mg／kg，上海旭東藥業(yè)）終止發(fā)作。對(duì)照組小鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射。P+G組，待癲癇小鼠終止發(fā)作后給予 G-CSF（10 μg／kg，Novus ）皮下注射，每天注射1次，連續(xù)注射3 d。

分組：按照完全隨機(jī)法將小鼠隨機(jī)分成3組。A：對(duì)照組（Control組）：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物僅用等藥物體積生理鹽水注射，共8只。B：匹羅卡品處理組（P組）：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射匹羅卡品，共15只。C：匹羅卡品和G-CSF處理組（P+G組）：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射匹羅卡品后皮下注射G-CSF，共15只。

每組隨機(jī)抽取經(jīng)藥物處理3 d的小鼠（每組4只），待10%水合氯醛麻醉后，使用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦。將腦組織置于4%的多聚甲醛中4℃過(guò)夜固定，后放入30%蔗糖中進(jìn)行脫水，待腦組織沉底后行連續(xù)冠狀冰凍切片，得10 μm腦切片，-80℃保存?zhèn)溆?。其余小鼠在麻醉下斷頭取腦，分離出海馬組織儲(chǔ)存于液氮中，直到用于Western Blot分析。

1.2 免疫熒光染色每組隨機(jī)抽取8張冰凍切片4℃復(fù)溫，山羊血清（中山金橋）室溫封閉。封閉后滴加抗 G-CSF 抗體（1∶1000 ，Abcam，兔單克隆抗體）和自帶熒光的抗GFAP抗體（1∶1000，Abcam，小鼠單克隆抗體，紅色）混合液。4℃避光孵育過(guò)夜。 依次滴加熒光二抗（1∶500，Abcam，驢抗兔，綠色），DAPI?？篃晒馑p劑封片后，放置于熒光顯微鏡下觀察及圖像采集。

1.3 尼氏染色隨機(jī)抽取8張冰凍切片置于4℃冰箱中復(fù)溫，依次放入60℃的0.5%甲苯胺藍(lán)水溶液、70%酒精、100%乙醇和二甲苯溶液中。中性樹膠封片，采用普通顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.4 Western-Blot檢測(cè)把冷凍的海馬組織放入裂解緩沖液和PMSF（碧云天）混合液中，離心提取蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（碧云天）測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)12%十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離海馬組織裂解的蛋白質(zhì)（30 μg/泳道，bio-tanon），并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。后使用抗 IL-Iβ 抗體（1：1000，Santa Cruz，兔單克隆抗體）浸泡，4℃過(guò)夜。滴加二抗（山羊抗兔IgG；1：5000 稀釋； Santa Cruz）室溫孵育 2 h。 通過(guò) ECL發(fā)光液（Millipore）使蛋白條帶可見。檢測(cè)抗GFAP抗體（1：1000，Abcam，兔單克隆抗體）、抗 IL-6β抗體（1：1000，Abclonal，兔單克隆抗體）、抗 G-CSF抗體（1：1000 ，Abcam，兔單克隆抗體）時(shí)除一抗不同，其余實(shí)驗(yàn)步驟相同。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。使用imageJ軟件，通過(guò)光密度法量化條帶，并且以β-actin(1：100000，Abclonal)相對(duì)密度作為內(nèi)參表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s)表示，三組之間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。使用Graphpad Prism 6.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 癲癇動(dòng)物模型30只小鼠經(jīng)匹羅卡品處理后，26只小鼠出現(xiàn)了SE，概率為86.67%；SE過(guò)程中死亡7只，SE后死亡2只。在造模成功并且存活的17只小鼠中，隨機(jī)抽取9只為P+G組，進(jìn)行皮下注射G-CSF，未出現(xiàn)死亡。對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)SE和自發(fā)性癲癇發(fā)作。

2.2 G-CSF在腦組織中的表達(dá)使用免疫熒光雙染技術(shù)鑒定G-CSF在小鼠海馬中的表達(dá)。鏡下可見G-CSF綠色熒光呈陽(yáng)性（圖1-A1），GFAP為紅色熒光（圖1-A2），細(xì)胞核為藍(lán)色熒光（圖1-A3），疊加后可見G-CSF與GFAP細(xì)胞核完全重疊（圖1-A4）。

圖1 免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)G-CSF（箭頭所示）在AST中的表達(dá)情況（400×）

2.3 尼氏染色結(jié)果鏡下：Control組（圖2-C）可見排列整齊、緊密、形態(tài)規(guī)則的大量尼氏小體（Nissl body），神經(jīng)元胞體呈多角形。P組（圖 2-P）CA1區(qū)典型神經(jīng)病理學(xué)改變，包括神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常或丟失，核縮小，尼氏小體散在分布、排列紊亂，尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較C組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。P+G 組（圖 2-P+G）注射 G-CSF 后明顯改善海馬CA1區(qū)的組織結(jié)構(gòu)，尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較P組有明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 尼氏染色。C為對(duì)照組，P為匹羅卡品組，P+G為經(jīng)GCSF干預(yù)的匹羅卡品組。各組海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元的表達(dá)（400×），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P＜0.01）

2.4 Western BlotA圖表示的是曝光條帶，B圖是根據(jù)曝光條帶灰度分析后所做柱狀圖?？梢奝組 GFAP、IL-1β、IL-6的表達(dá)較 control組、P+G 組明顯增高 （P＜0.05）；P組G-CSF表達(dá)明顯高于control組 （P＜0.05）；P+G組 G-CSF表達(dá)高于 P組，在外源性G-CSF刺激下，海馬神經(jīng)元自分泌G-CSF 增加（P＜0.05 ）（見圖 3）。

圖 3 Western-Blot檢測(cè) GFAP、IL-1β、IL-6、G-CSF 在各組小鼠海馬組織中的表達(dá)。C為對(duì)照組，P為匹羅卡品組，P+G為經(jīng)G-CSF 干預(yù)的匹羅卡品組（*P＜0.05，**P＜0.01 ）

3 討論

G-CSF與G-CSF-R廣泛分布于在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)[6]，可能通過(guò)其受體G-CSFR提高AKT的磷酸化，從內(nèi)源性和外源性兩個(gè)途徑抑制氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[7]。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了G-CSF在幾種神經(jīng)病理狀態(tài)下的保護(hù)作用，包括抗凋亡、抗炎、刺激神經(jīng)元生成等[8-9]。然而，尚未有研究調(diào)查G-CSF是否減弱TLE匹羅卡品模型至癇期SE誘發(fā)的AST異常增生和神經(jīng)炎癥反應(yīng)等。

星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨前d癇的病理標(biāo)志[10]，在所有癲癇動(dòng)物模型中均能觀察到與癲癇活動(dòng)相關(guān)的腦區(qū)中AST的異?；罨痆11]。研究表明[12-13]在腦卒中動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)注射G-CSF后活化的AST減少，腦損害程度也同時(shí)減輕。我們的實(shí)驗(yàn)在腦組織免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明G-CSF在AST上大量表達(dá)。對(duì)TLE模型小鼠連續(xù)3天行皮下注射G-CSF治療后，AST較TLE模型組較少?？梢哉f(shuō)明G-CSF具有降低AST異常增生的作用。

炎癥是癲癇發(fā)作起始和維持的基本因素，促炎細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α等已被證明可增加神經(jīng)元興奮性和同步性，從而增加癲癇發(fā)作的幾率[14]。在這種情況下，我們的實(shí)驗(yàn)證明G-CSF降低SE小鼠海馬中促炎性細(xì)胞因子IL-1β和L-6的水平。同時(shí)，外源性G-CSF能夠刺激海馬神經(jīng)元自分泌G-CSF，從而形成正反饋，進(jìn)一步降低AST的異常增生和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

綜上所示，我們研究的G-CSF在癲癇小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，并能降低腦組織中的炎癥因子，提示G-CSF可能參與癲癇的保護(hù)作用。因此G-CSF可能成為癲癇治療的潛在新藥，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)還在逐步完善，有待于我們進(jìn)一步的研究。