王 震 ， 董 彬 ， 樊振川 ，2，3， 孟德梅 *，2，3

（1.天津科技大學 教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津 300457；2.天津市食品營養(yǎng)與安全和藥物化學聯(lián)合實驗室，天津300457；3.天津科技大學 新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

纖毛是存在于細胞表面具有運動或感知功能的細胞器，多項研究報道，纖毛的結構或功能障礙會導致許多疾病[1-4]，如多囊腎病、視網(wǎng)膜變性、慢性呼吸疾病、腦積水和不孕等。為了預防和治療這些疾病，許多研究者對纖毛內(nèi)各種蛋白質(zhì)組分、結構及其作用機理進行了大量研究[5-7]。纖毛的運動和感知是由馬達蛋白、IFT顆粒、BBS等元件來維持的，其中IFT顆粒是維持纖毛功能所必須的[8]。研究表明，IFT顆粒包含至少20種蛋白質(zhì)組分，這些組分形成一個復合物整體，可以運送細胞體內(nèi)蛋白質(zhì)進出纖毛[9]。IFT顆粒中蛋白質(zhì)組分的構象改變或缺失將會引起纖毛的組裝和功能障礙[4，6]。

IFT顆粒包含IFT-A和IFT-B復合物，兩者分別包含6種和14種組分，還有一些新成員將不斷被發(fā)現(xiàn)[8，10]。IFT顆粒的各個組分在各個物種間幾乎呈高度保守性，但是在秀麗隱桿線蟲和果蠅中卻沒有發(fā)現(xiàn)IFT-B復合物的組分IFT25，暗示著IFT25可能區(qū)別于其他常規(guī)的IFT-B復合物組分，在纖毛運輸系統(tǒng)中發(fā)揮特殊的作用[10]。在萊茵衣藻中研究發(fā)現(xiàn)，IFT25是一種磷酸化蛋白質(zhì)，可以和IFT27結合，促進IFT27的穩(wěn)定性和可溶性，說明兩者可能有功能上的關聯(lián)[11]。在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，IFT25缺陷型不出現(xiàn)纖毛結構和長度的明顯變化，說明IFT25不參與纖毛的組裝，但是發(fā)現(xiàn)其在維持Hedgehog信號正確傳導中發(fā)揮作用。同時在小鼠的研究中，IFT25缺陷型細胞中沒有發(fā)現(xiàn)有絲分裂缺陷，這可能表明哺乳動物中不需要IFT25調(diào)控細胞周期[12]。目前關于IFT25的作用機制尚不清晰，因此深入研究模式生物萊茵衣藻中IFT25在纖毛組裝、纖毛內(nèi)物質(zhì)運輸及信號傳導中的作用機制具有重要意義。

制備特異性和靈敏性的萊茵衣藻IFT25抗體，是順利完成IFT25在蛋白水平表達模式、以及IFT25與其他蛋白質(zhì)互作機制研究的重要前提。作者雖在2009年對萊茵衣藻IFT25和IFT27的互作進行了詳細研究[11]，但是至今沒有商品化的萊茵衣藻IFT25抗體可供研究者使用，也沒有關于萊茵衣藻IFT25抗體制備方法的報道。作者采用經(jīng)濟和簡單的方法，以原核表達萊茵衣藻IFT25為抗原制備兔源多克隆抗體，并運用多種方法進行抗體純化以提高抗體的特異性，從而為全面闡明IFT25在纖毛中的具體作用機制及理解纖毛相關疾病的致病機理奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌 XL1-blue，BL21（DE3） 感受態(tài)，pGEX-2T-ift25-lcc-his-ift27 質(zhì)粒：均為作者所在實驗室保存；萊茵衣藻cc125藻種：作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑DNA Marker（1 000 bp、100 bp）、dNTPs：購自全式金公司；T4DNA連接酶、Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶（BamH I、Hind III）、彩色預染蛋白Marker、IPTG：購自 Fermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：均購自索萊寶公司；引物合成和基因測序：由北京奧科鼎盛公司完成；HRP標記的山羊抗兔IgG：購自康為世紀；Dextrin SepharoseTMHigh Performance、Ni SepharoseTM6 Fast Flow、Protein ASepharoseTM：購自 GE 公司。

1.1.3 實驗動物新西蘭大白兔2只，8周齡大，體重1.5～2.0 kg，由天津歐陽實驗種兔場提供。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體構建實驗室保存的pMAL-c2X 和 pET-28a（+）表達載體用 BamH I、Hind III進行雙酶切，并進行切膠回收；以表1中設計的引物PCR擴增出ift25，用BamH I、Hind III進行雙酶切，產(chǎn)物純化回收目的基因；將目的基因分別與兩個載體用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-blue 中，分別涂到含氨芐青霉素（120 μg/mL）、卡那霉素（30 μg/mL）的LB平板上篩選陽性菌落；挑取陽性菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測序驗證。

表1 擴增ift25所用引物序列Table 1 Sequences of the PCR primers for the gene of ift25

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導表達驗證將正確重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，在分別含氨芐青霉素（120 μg/mL）和卡那霉素（30 μg/mL）的LB平板上篩選含pMAL-c2X-ift25和pET-28a（+）-ift25陽性菌落；挑取陽性菌落過夜培養(yǎng)，然后按照5%接種體積分數(shù)分別轉(zhuǎn)接到5 mL含氨芐青霉素（120 μg/mL）和卡那霉素（30 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至 OD600值到0.6～0.8， 加入終濃度 0.2 mmol/L的 IPTG，25℃、180 r/min誘導表達6 h，收集菌體進行SDS-PAGE分析[13-14]。

1.2.3 融合蛋白MBP-IFT25的純化將含pMAL-c2X-ift25重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)過誘導表達后，超聲波破碎菌體細胞，離心收集上清液。含融合蛋白上清液用Dextrin SepharoseTMHigh Performance進行親和純化，純化條件為：結合緩沖液 A（20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% β-巰基乙醇，pH 7.4）， 洗脫緩沖液 A（20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% β-巰基乙醇，10 mmol/L 麥芽糖，pH 7.4），將洗脫出的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分析[15]。

1.2.4 融合蛋白6×His-IFT25的純化含pET-28a（+）-ift25重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)過誘導表達后，菌體細胞進行超聲波破碎，離心收集包涵體。包涵體用洗滌液緩沖液 （50 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，1 mol/L 尿素，1%TritonX-100，pH 8.0）洗滌 3次后，然后用變性緩沖液 （20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 進行變性溶解。融合蛋白在變性條件下用Ni SepharoseTM6 Fast Flow進行親和純化，純化條件為：結合液緩沖液B（20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿 素 ，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），分別用含有 60、100、300 mmol/L 咪唑的洗脫液緩沖液B （20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 進行梯度洗脫，洗脫出的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分析[16-17]。

1.2.5 多克隆抗體的制備取兩只8周大的新西蘭大白兔，在實驗室適應一周后準備免疫。初次免疫前在耳源靜脈取血，分離血清，在后續(xù)試驗中作為陰性血清；初次免疫，取2 mg MBP-IFT25與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，在兔子頸背部選多點皮下注射；10～14 d后進行加強免疫，取2 mg MBPIFT25與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化，在兔子頸背部多點皮下注射；之后每次加強免疫前耳源取血，ELISA測定抗血清的效價，當效價滿足試驗要求，加強免疫后一周取血分離抗血清[18-20]。

1.2.6 ELISA測定抗血清效價酶標板每孔包被1 μg融合蛋白MBP-IFT25，0.5%的脫脂奶粉封閉，抗血清和陰性血清設定稀釋梯度為 1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000，二抗為辣根過氧化物酶（HPR）標記的山羊抗兔 IgG（1∶20 000），TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基聯(lián)苯胺）顯色后測定OD450，抗血清OD450/陰性血清OD450≥2.0為陽性，其最高稀釋倍數(shù)為抗血清的效價[19]。

1.2.7 抗血清的純化分離完的抗血清用Protein A SepharoseTM進行純化，純化條件為：結合緩沖液C（12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脫緩沖液C（0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.7），流速 0.5 mL/min。收集吸收峰對應的洗脫液，用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）將洗脫液pH值調(diào)至中性。Protein ASepharoseTM純化完的抗體用硝酸纖維素膜親和法[21]進一步純化，將6×His-IFT25經(jīng)過SDS-PAGE和電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（PVDF）上，麗春紅染色后剪下目的條帶，5%脫脂奶粉封閉后與經(jīng)過Protein A SepharoseTM的抗體4℃結合過夜，用洗脫緩沖液C進行洗脫，收集洗脫液并將pH值調(diào)至中性。

1.2.8 Western blotting檢測多克隆抗體的特異性萊茵衣藻cc125接種到Tris-Acetate-Phosphate（TAP）[22]培養(yǎng)基中室溫光照培養(yǎng) 3 d，取 1 mL加入離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；向沉淀中加入54 μL Buffer A （工作濃度0.1 mol/L的Na2CO3）和 6 μL DTT（1 mol/L），渦旋振蕩器振蕩 5 s重懸衣藻細胞；向離心管中繼續(xù)加入40 μL Buffer B（5%SDS、30%蔗糖），室溫振蕩 45 min；10 000 r/min離心5 min，收集上清液。取4 μL衣藻上清液加入1 μL 5×上樣緩沖液混勻，進行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)印后，衣藻蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉；多克隆抗體稀釋度1：1000，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔 IgG（1：5000），加入顯色液后曝光壓片顯色或曝光照相[20]。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的構建及鑒定

兩套重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結果見圖1。兩套重組質(zhì)粒均獲得了570 bp的片段，并將重組質(zhì)粒送到金唯智公司測序，測序引物選擇通用引物，經(jīng)過對比序列完全正確，說明表達載體構建成功，將其分別命名為 pMAL-c2X-ift25 和 pET-28a（+）-ift25。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切驗證Fig.1 Double enzyme verification of recombinant plasmid

2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達及融合蛋白的可溶性分析

pMAL-c2X-ift25和 pET-28a （+）-ift25均轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。含pMAL-c2X-ift25的菌體經(jīng)過IPTG誘導，SDS-PAGE在60 000處出現(xiàn)目的條帶，而未經(jīng)誘導的含重組質(zhì)粒的菌體蛋白沒有此帶，說明目的MBP-IFT25成功表達；將誘導完的菌體經(jīng)過超聲破碎，目的條帶主要出現(xiàn)在上清液中，而沉淀中則幾乎沒有，說明融合蛋白呈水可溶性，見圖2。含pET-28a（+）-ift25的菌體經(jīng)過IPTG誘導，SDS-PAGE在20 000附近出現(xiàn)目的條帶，而未經(jīng)誘導的空白對照則沒有此帶，說明6×His-IFT25成功表達，而且主要分布在沉淀中，說明6×His-IFT25主要以包涵體形式表達。這與之前報道相同，即MBP對融合蛋白有促水溶作用[14]；本試驗中6×His與IFT25融合表達時融合蛋白的水溶性較差。

圖2 SDS-PAGE檢測重組表達載體pMAL-c2X-ift25和pET-28a（+）-ift25 在 E.coli BL21（DE3）中的表達及融合蛋白的可溶性Fig.2 SDS-PAGE analyzed the expression of recombinant vector pMAL-c2X-ift25 and pET-28a（+）-ift25 in E.coli BL21 （DE3） and the solubility of fusion protein

因為呈水溶型的目的蛋白可以保持蛋白質(zhì)的天然構象，制備的抗體可以更特異性的結合目的蛋白，包涵體在變性溶解、復性操作后可以恢復蛋白質(zhì)的天然構象，但是在提高復性效率上存在諸多難度和挑戰(zhàn)，而且不能達到完全復性。因此，作者選擇呈水溶性的MBP-IFT25作為免疫動物的抗原；包涵體6×His-IFT25則用于抗體的膜純化[21]。

2.3 融合蛋白的純化

融合蛋白MBP-IFT25和6×His-IFT25經(jīng)過親和純化后，用SDS-PAGE進行分析，見圖3。結果表明兩個融合蛋白的相對分子質(zhì)量正確，且經(jīng)灰度分析（SAGECREATION凝膠成像儀）表明，兩者純度均達90%以上。

圖3 MBP-IFT25和6×His-IFT25的親和純化Fig.3 Affinity purification of MBP-IFT25 and 6×His-IFT25

2.4 ELISA測定抗血清效價及多克隆抗體的特異性檢測

融合蛋白MBP-IFT25作為抗原免疫兩只新西蘭大白兔，用ELISA測定免疫過程中的抗血清效價，結果在第四次免疫后12 d，兩只兔子的抗血清效價均超過1 280 000，見圖4，滿足試驗要求，于第五次免疫后一周取血分離抗血清。

圖4 間接ELISA法測定抗血清的效價Fig.4 Results of ELISA test of anti-IFT25 polyclonal antiserum

取兔子1抗血清首先經(jīng)過Protein A純化，結果見圖5，再進行抗原-抗體膜純化。用Western blotting檢測其識別萊茵衣藻中IFT25的特異性，經(jīng)過顯色可以在20 000附近識別出單一條帶，條帶相對分子質(zhì)量大小符合預期，見圖6，即制備的多克隆抗體可以特異性識別IFT25，可以直接用于后續(xù)對IFT25的研究。

圖5 Protein A純化IFT25的抗血清Fig.5 Anti-IFT25 was purified by protein A

圖6 Western blotting分析IFT25多克隆抗體的特異性Fig.6 Western blotting analysis of the specificity of IFT25polyclonal antibody

3 結 語

IFT25作為纖毛內(nèi)運動蛋白IFT復合物B中的一個重要組分，在纖毛運動和感知中的作用機制仍不清晰。制備特異性和靈敏性的IFT25抗體，來檢測其在模式生物萊茵衣藻中的表達模式及與其他IFT成員的互作機制是闡明IFT25在生物體內(nèi)作用機制的重要方式。作者成功構建了MBP-IFT25和6×His-IFT25兩種融合蛋白，親和純化后蛋白質(zhì)純度超過90%。并用水溶性的MBP-IFT25融合蛋白作為抗原制備其多克隆抗體，ELISA測定效價超過128 000。依次經(jīng)Protein A和硝酸纖維素膜純化制備的抗體，用Western blotting檢測具有很好的特異性，能夠正確的特異性識別萊茵衣藻中的IFT25蛋白質(zhì)，表明所制備的IFT25抗體可以直接用于ELISA、Western blotting及活體中的檢測，為IFT25作用機制的闡明和纖毛相關疾病的診斷提供了重要理論和方法支持。