馮小強(qiáng), 李小芳, 朱元成

(天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院, 甘肅 天水 741001)

由于防癌、 抗腫瘤藥物的藥效發(fā)揮與脫氧核糖核酸(DNA)之間存在的嵌插結(jié)合方式有關(guān)[1], 因此, 研究藥物與DNA之間的作用機(jī)制對尋找抗腫瘤藥物意義重大. 甲殼素在自然界中含量豐富, 可從甲殼類動(dòng)物外殼、 節(jié)肢動(dòng)物表皮等生物組織中提取. 殼聚糖是甲殼素脫N-乙?；蟮漠a(chǎn)物, 低分子量殼聚糖又稱殼寡糖, 具有廣譜抑菌性和抗癌活性[2]. 殼聚糖能減小原發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞A375粘連, 有效抑制細(xì)胞SKMEL28的繁殖, 對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞RPM17951有較好的促凋亡作用, 并能抑制半光天冬酶, 即殼聚糖可通過線粒體影響細(xì)胞凋亡, 是一種有潛質(zhì)的抗黑色素瘤靶向藥物[3]. 文獻(xiàn)[4]通過離子交聯(lián)制備并研究了姜黃素/5-氟尿嘧啶負(fù)載硫脲殼聚糖納米粒子(CPC-TCS-NPs/5-FU-TCS-NPs)對結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)的抑制活性, 發(fā)現(xiàn)5-FU-TCS-NPs和CRC-TCS-NPs具有較好的生物相容性, 對HT29的抑制力分別較姜黃素和5-氟尿嘧啶提高了2.5～3倍; 文獻(xiàn)[5]將姜黃素和5-氟尿嘧啶分別與N,O-羧甲基殼聚糖納米粒子(N,O-CMC NPs)混合, 得到復(fù)合納米藥物5-FU-N,O-CMC NPs和CUR-N,O-CMC NPs, 發(fā)現(xiàn)它們具有良好的生物相容性, 對HT29的抑制效果較姜黃素和5-氟尿嘧啶均有提高.

鄰香草醛與胺縮合生成的Valen類席夫堿具有較好的抗菌活性, 鄰香草醛提供了配位能力較強(qiáng)的氧, 因而可得到結(jié)構(gòu)更豐富、 種類更多的配位化合物[6-8]. 本文利用鄰香草醛和殼寡糖反應(yīng)生成的席夫堿, 與不同物質(zhì)的量比的Cu2+配位合成配合物, 并采用循環(huán)伏安法、 紫外-可見吸收光譜、 DNA黏度和熔點(diǎn)測定, 分析席夫堿及其配合物與DNA之間的作用機(jī)制, 為設(shè)計(jì)高效抗癌藥物提供有益參考.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

氯化銅(分析純, 西安化學(xué)試劑廠); 鯡魚精DNA(美國Sigma公司); 殼寡糖(相對分子質(zhì)量<5 000, 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司); 鄰香草醛(分析純, 上海中秦化學(xué)試劑有限公司). UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(UV-Vis, 日本島津公司); SP-752型紫外-可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司); CHI660B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司); Spectrum One3.0型Fourier紅外光譜儀(FT-IR, 美國Perkin Elmere公司).

1.2 席夫堿及銅配合物的制備

1.3 配合物與鯡魚精DNA之間的作用

通過循環(huán)伏安法、 紫外吸收光譜、 DNA的黏度及熔點(diǎn)測定, 考察配合物與鯡魚精DNA之間的相互作用, 實(shí)驗(yàn)過程參見文獻(xiàn)[9-10].

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安法

VCOS-Cu13(A)和VCOS-Cu31(B)的循環(huán)伏安曲線如圖1所示. 由圖1可見: 當(dāng)掃描速率v=0.1 V/s時(shí), 席夫堿VCOS未出現(xiàn)氧化還原峰, VCOS-Cu13分別在0.073,0.425 V處出現(xiàn)2個(gè)較強(qiáng)的氧化峰, VCOS-Cu31分別在-0.023,0.401 V處也出現(xiàn)2個(gè)明顯的氧化峰, 但還原峰均較弱, 表明VCOS與Cu2+參與配位反應(yīng); 隨著掃描速度的逐漸增大, VCOS-Cu13和VCOS-Cu31的氧化峰電位發(fā)生正移, 氧化峰電流Ipa也隨之增大.

(A) 1～14掃描速率v分別為0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7 V/s; (B) 1～10掃描速率v分別為0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 V/s.圖1 VCOS-Cu的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammograms of VCOS-Cu

圖2 Ipa-v的關(guān)系曲線Fig.2 Relationship curves of Ipa-v

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的掃描速率范圍內(nèi),Ipa-v的關(guān)系曲線如圖2所示. 由圖2可見, 配合物VCOS-Cu13和VCOS-Cu31的氧化峰電流分別與掃描速率間存在線性關(guān)系, 表明兩種配合物在玻碳電極上的反應(yīng)均由吸附過程控制[11]. VCOS-Cu31(A)和VCOS-Cu13(B)的循環(huán)伏安曲線如圖3所示. 在4 mL 1×10-4mol/L的配合物溶液中, 用1×10-5mol/L的DNA滴定, 作用10 min后未出現(xiàn)新峰, 但峰電流降低. 設(shè)定掃描速度為0.5 V/s, 當(dāng)?shù)渭覦NA的體積為120 μL時(shí), 配合物VCOS-Cu13在0.288 7 V附近的氧化峰正移至0.377 V處, 峰電流從-3.702×10-5A升至-2.008×10-5A； VCOS-Cu31在0.460 6 V附近的氧化峰正移至0.486 V處, 峰電流從-1.941×10-5A升至-1.485×10-5A, 但這兩種配合物的還原峰電位位移均不明顯. 若藥物小分子與DNA之間存在插入結(jié)合, 則會(huì)使小分子的峰電位發(fā)生正移, 同時(shí)峰電流有減小趨勢[12]. 由圖3可見, VCOS-Cu13和VCOS-Cu31均以嵌插方式與DNA作用, 形成了非電活性的復(fù)合物， 且加入DNA后, 藥物小分子的氧化還原峰電流的減小程度、 峰電位的正移程度與DNA嵌插結(jié)合程度呈正相關(guān), 即小分子的氧化還原峰電流下降越多， 峰電位的正移趨勢越明顯, 小分子與DNA的嵌插結(jié)合力越強(qiáng). VCOS-Cu13與DNA的作用較VCOS-Cu31強(qiáng), 這可能是由于配合物VCOS-Cu13中含有的金屬Cu2+離子數(shù)量較多, 電子云密度較高, 更利于與DNA結(jié)合所致, 即Cu2+含量越大, 配合物與DNA的結(jié)合越容易、 越穩(wěn)定.

c(配合物)=1×10-4 mol/L; 1～5: 加入DNA溶液的體積分別為0,60,80,100,120 μL.圖3 配合物的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of complexes

圖4 1/(Δ Ipa)與1/c(DNA)的關(guān)系曲線Fig.4 Relationship curves of 1/(Δ Ipa) and 1/c(DNA)

2.2 紫外-可見吸收光譜法

席夫堿及兩種銅配合物在加入DNA前后的紫外-可見吸收光譜如圖5所示. 由圖5可見： 在濃度為0.1 mmol/L的席夫堿及銅配合物中依次加入DNA后, 特征吸收峰的峰位呈明顯紅移趨勢, 吸收峰強(qiáng)度發(fā)生不同程度的變化; 在加入300 μL DNA后, VCOS原位于201.4 nm處的吸收峰逐漸消失, 原位于228.8 nm處吸收峰峰位紅移0.6 nm, 增色47.85%, 原位于277.8 nm處吸收峰峰位紅移14.2 nm, 增色35.15%； VCOS-Cu13原位于201.6 nm的吸收峰減色11.25%, 峰位紅移25 nm, 但在290 nm附近出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰, 且強(qiáng)度隨DNA加入量的增大而增強(qiáng)； VCOS-Cu31原位于202.0 nm的強(qiáng)吸收峰減色48.68%, 峰位紅移20 nm, 原位于276.4 nm的強(qiáng)吸收峰增色22.82%, 峰位紅移10.2 nm. 小分子的吸收光譜出現(xiàn)紅移現(xiàn)象和減色效應(yīng)可作為小分子與DNA發(fā)生嵌插結(jié)合的依據(jù)[13], 進(jìn)一步證明席夫堿及兩種銅配合物以嵌插方式與DNA發(fā)生相互作用.

c(配合物)=1×10-4 mol/L; c(DNA)=1.0×10-5 mol/L; 1～4: 加入DNA溶液的體積分別為0, 100, 200, 300 μL. 圖5 配合物的紫外-可見吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorption spectra of complexes

2.3 黏度法

設(shè)定DNA的濃度不變, 向DNA溶液中依次加入席夫堿或配合物后, DNA的相對黏度增大, 且黏度增大程度與席夫堿或配合物的濃度呈正相關(guān), 如圖6所示. 若外來小分子與DNA之間存在嵌插, 則DNA溶液的黏度會(huì)增加[14]. 可見, 配合物以嵌插方式與DNA作用, 從而使DNA雙螺旋鏈伸長, 黏度增大.

2.4 DNA熔點(diǎn)的測定

席夫堿及配合物對DNA熔點(diǎn)可產(chǎn)生不同程度的影響, 結(jié)果如圖7所示. 由圖7可見, 單獨(dú)DNA的變性溫度為70 ℃， 分別與VCOS,VCOS-Cu31和VCOS-Cu13結(jié)合后, DNA的變性溫度分別升至71.2,73.4,80 ℃, 配合物與DNA的嵌插作用會(huì)導(dǎo)致DNA熔點(diǎn)升高, 且升高幅度與結(jié)合強(qiáng)度呈正相關(guān)[15-16]. DNA熔點(diǎn)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, VCOS,VCOS-Cu31和VCOS-Cu13均可嵌入DNA的堿基對中, 使DNA穩(wěn)定性升高, 其中VCOS-Cu13嵌入DNA堿基對的能力最強(qiáng), VCOS最弱.

圖6 配合物對DNA黏度的影響Fig.6 Effects of complexes on viscosity of DNA

圖7 配合物對DNA熔點(diǎn)的影響Fig.7 Effects of complexes on melting point of DNA

綜上可見, VCOS-Cu31和VCOS-Cu13配合物具有電化學(xué)活性, 當(dāng)掃描速率為0.025～1.0 V/s時(shí), 配合物在電極上的反應(yīng)過程主要由吸附過程控制. 向其中加入DNA后, 配合物的氧化峰電流減小, 峰電位正移. 配合物在加入DNA后, 其吸收峰的峰位發(fā)生紅移, 吸光強(qiáng)度顯著減色. 同時(shí), DNA的相對黏度和熔點(diǎn)在加入配合物后均有增大趨勢. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 配合物VCOS-Cu31和VCOS-Cu13均以嵌插結(jié)合模式與DNA作用, 但嵌插程度較弱; VCOS-Cu13和VCOS-Cu31與DNA均可形成1∶1(物質(zhì)的量比)的配合物, 結(jié)合常數(shù)分別為0.78×104,0.69×104L/mol.