， ，

(山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250014)

神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的基本形式是電信號(hào)，突觸后電位就是其中的一種。大量排列整齊的神經(jīng)纖維形成的突觸后電位，整合為場(chǎng)突觸后電位。場(chǎng)突觸后電位能夠很好地衡量突觸傳遞強(qiáng)度，是評(píng)價(jià)突觸傳遞效能的重要指標(biāo)，也為研究突觸可塑性的分子機(jī)制提供了有效手段。20世紀(jì)50年代，研究者就開始應(yīng)用電刺激方法在海馬復(fù)合體中記錄誘發(fā)突觸后場(chǎng)電位，從而為研究海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制開辟了新途徑[1]。隨后，研究者將誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位記錄技術(shù)運(yùn)用到有纖維連接的不同腦區(qū)，如內(nèi)側(cè)前額葉和伏隔核2個(gè)腦區(qū)。組織解剖學(xué)研究表明,內(nèi)側(cè)前額葉有大量谷氨酸能神經(jīng)纖維投射至伏隔核，這些神經(jīng)投射纖維在伏隔核背部(側(cè)腦室底端)相對(duì)集中且排列整齊，因此通過(guò)電刺激內(nèi)側(cè)前額葉，可以在伏隔核誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位[2-4]。由于該通路在目標(biāo)導(dǎo)向行為以及動(dòng)機(jī)行為中扮演重要角色，因此，研究該通路所發(fā)生的神經(jīng)適應(yīng)性改變對(duì)揭示目標(biāo)導(dǎo)向或動(dòng)機(jī)行為內(nèi)在神經(jīng)機(jī)制具有重要價(jià)值[5-7]。

RM6240生物信號(hào)記錄系統(tǒng)是集放大器、濾波器、模數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換以及刺激隔離器一體的電信號(hào)記錄分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)采樣頻率最高可達(dá)400 kHz，通常記錄場(chǎng)電位所采用的采樣頻率為1～2 kHz。同時(shí)，該系統(tǒng)的低通濾波截止頻率可高達(dá)10 kHz，而高通濾波頻率可以為直流(0 Hz)或截止頻率低達(dá)0.016 Hz；電位響應(yīng)靈敏度最大為2 μV/div。此外，刺激隔離器可以產(chǎn)生各種單脈沖、雙脈沖以及連續(xù)單脈沖刺激，且可以在電流或電壓模式切換，刺激選擇比較靈活。由此可見，RM6240型系統(tǒng)具備開展誘發(fā)場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)的條件。

盡管RM6240型生物信號(hào)記錄系統(tǒng)被廣泛用于大學(xué)生理學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，但是大部分院校并沒有面向?qū)W生開展誘發(fā)場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)，其主要原因是基于該系統(tǒng)的誘發(fā)場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)未被搭建。本文中應(yīng)用RM6240型系統(tǒng)，并結(jié)合自制電極，嘗試記錄內(nèi)側(cè)前額葉-伏隔核通路中誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位；同時(shí)，探索合適的方法以完善實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，為學(xué)生開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供相應(yīng)的參考。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑包括：鎳鉻合金絲，美國(guó)California Fine Wire公司；水合氯醛，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司；尼氏染色液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

主要儀器包括：RM6240C型系統(tǒng)和SWF-1D型微電極放大器，成都儀器廠；Cryostar NX 50型冰凍切片機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SMZ745T型解剖鏡成像系統(tǒng)， 日本Nikon公司； MATLAB軟件， 美國(guó)MathWorks公司； pClamp10軟件， 美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性Wistar大鼠， 體質(zhì)量為250～310 g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證SCXK(魯2013-0009)。動(dòng)物飼養(yǎng)于恒定溫度為(23±1)℃及相對(duì)濕度為50%～60%的飼養(yǎng)房中，可以自由取食和飲水。動(dòng)物在飼養(yǎng)房中適應(yīng)1周后，開始被用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 電極

電極材質(zhì)為特氟龍包被的鎳鉻合金絲，直徑為100 μm。首先，剪裁適當(dāng)長(zhǎng)度的合金絲(長(zhǎng)度取決于目標(biāo)腦區(qū))若干，將合金絲一端特氟龍包被層剝離(長(zhǎng)度約為2 mm)，焊接于排母座上，將2股合金絲均勻地纏繞在一起。然后，修剪(傾斜45°)以保證2股合金絲尖端有一定高度差(0.5～1 mm)。最后，基座和合金絲連接處用絕緣膠密封，以保證電極阻抗為0.5～0.8 MΩ，放置備用。

1.4 誘發(fā)場(chǎng)電位記錄及數(shù)據(jù)分析

本研究中采用腦立體定位儀以精確定位內(nèi)側(cè)前額葉和伏隔核。內(nèi)側(cè)前額葉屬于皮質(zhì)，位于顱骨下淺層，定位相對(duì)容易，但是伏隔核屬于皮質(zhì)下深部核團(tuán)，定位較難。另外，2個(gè)腦區(qū)解剖位置較近，前后相差約2.2 mm，因此，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)伏隔核定位的操作臂向尾部方向傾斜10°，以便對(duì)內(nèi)側(cè)前額葉定位的操作臂進(jìn)行操作。

稱取大鼠體質(zhì)量，按照400 mg/kg的劑量，向其腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的水合氯醛進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉(僅用于手術(shù))。待大鼠呼吸均勻平緩，且對(duì)后肢疼痛刺激無(wú)收縮反射后，將其固定于立體定位儀上，調(diào)整兩側(cè)耳桿使大鼠頭部正中線位于齒桿中央，固定耳桿和齒桿，確保大鼠顱骨平面水平。去除皮下結(jié)締組織以暴露顱骨，用少量體積分?jǐn)?shù)為2%的雙氧水清洗顱骨表面， 以使顱骨矢狀縫及冠狀縫更加清晰， 便于精確定位。 以前囟作為參照點(diǎn)， 對(duì)參照點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記并記錄其對(duì)應(yīng)坐標(biāo)， 依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[8]以及經(jīng)驗(yàn)確定內(nèi)側(cè)前額葉及伏隔核2個(gè)腦區(qū)的坐標(biāo)并進(jìn)行標(biāo)記。 內(nèi)側(cè)前額葉坐標(biāo)如下： 前囟前3 mm，矢狀縫旁開0.7 mm， 顱骨表面下4 mm。伏隔核坐標(biāo)如下：前囟前0.8 mm，矢狀縫旁開1.2 mm，顱骨表面下6～7 mm。標(biāo)記完畢后，用微型顱骨鉆在標(biāo)記點(diǎn)處鉆孔以暴露腦區(qū)。同時(shí)，打開RM6240型系統(tǒng)以及SWF-1D微電極放大器， 調(diào)整軟件控制界面， 以便觀察電信號(hào)。 將固定于操作臂上的刺激電極緩慢植入內(nèi)側(cè)前額葉， 接著將記錄電極緩慢植入到伏隔核， 在植入電極的同時(shí)觀察信號(hào)，待誘發(fā)場(chǎng)電位出現(xiàn)時(shí)， 停止電極植入。 需要注意的是， 由于大鼠個(gè)體差異， 因此電極植入的實(shí)際深度和預(yù)設(shè)深度有一定有出入。

確定信號(hào)后，異氟烷被用來(lái)維持大鼠麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，開始采集信號(hào)。信號(hào)經(jīng)過(guò)0.8～100 Hz帶通濾波后，采用10 kHz采樣頻率采集數(shù)據(jù)，電位響應(yīng)敏感度為1 mV/div。待信號(hào)穩(wěn)定后，開始實(shí)驗(yàn)。首先，測(cè)量刺激電流與場(chǎng)電位幅度反應(yīng)曲線。其次，根據(jù)反應(yīng)曲線，調(diào)整場(chǎng)電位幅度保持在最大幅度40%～50%的刺激電流作為基線刺激，開始持續(xù)記錄場(chǎng)電位信號(hào)(每30 s刺激一次)至少1 h。最后，場(chǎng)電位信號(hào)數(shù)據(jù)通過(guò)MATLAB以及pClamp10軟件離線分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。需要注意的是，在信號(hào)采集過(guò)程中確保動(dòng)物體溫穩(wěn)定。

1.5 組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 首先對(duì)腦區(qū)進(jìn)行電損毀， 電流強(qiáng)度為0.2 mA， 持續(xù)時(shí)間為10 s。 然后進(jìn)行灌流，灌注約250 mL生理鹽水后， 再緩慢灌注250 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛溶液。 繼而取出腦組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛溶液中后固定48 h， 再轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%蔗糖溶液進(jìn)行脫水48～96 h， 并保存在冰箱(4 ℃)里以待冰凍切片。 利用冰凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(厚度為30 μm)， 將包含內(nèi)側(cè)前額葉和伏隔核腦區(qū)的腦片貼片， 風(fēng)干后利用尼氏染色液進(jìn)行染色， 腦片經(jīng)一系列脫水和透明處理后迅速用中性樹膠封片。 用SMZ745T型解剖鏡成像系統(tǒng)觀察記錄電極與刺激電極尖端位置， 并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。應(yīng)用重復(fù)方差檢驗(yàn)分析信號(hào)隨時(shí)間變化的顯著性，顯著性水平P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在體記錄方法

利用自制電極進(jìn)行在體誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位記錄的方法見圖1。圖1(a)所示為2股鎳鉻合金絲，被用來(lái)作為刺激電極和記錄電極；需要注意的是，電極與基座封閉要嚴(yán)密，不然電信號(hào)易受到干擾，引入噪音。圖1(b)所示為在刺激電極未刺激之前記錄的基底噪音，平均電壓為-20～20 μV，基底噪音較理想。圖1(c)所示為刺激電極和記錄電極在相應(yīng)腦區(qū)位置的示意圖，如方法中所述，記錄電極向動(dòng)物尾部方向傾斜10°；需要注意的是，在開顱時(shí)避免腦組織出血，另外，內(nèi)側(cè)前額葉靠近矢狀縫，需要精確定位以防止破壞矢狀縫下血管。圖1(d)所示為場(chǎng)電位代表波形(10個(gè)連續(xù)記錄的波形疊加)，2條虛線之間的垂直距離被測(cè)量為電壓幅度，即刺激偽跡(圖中正峰值)前3 ms窗口內(nèi)電壓平均值與負(fù)峰值左右2 ms窗口內(nèi)電壓平均值之間的差值。RM6240系統(tǒng)自帶軟件并不能滿足本研究的數(shù)據(jù)分析需求，因此，本文中建立了基于pClamp10信號(hào)分析軟件的數(shù)據(jù)分析方法。利用MATLAB軟件將RM6240系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)文本文件轉(zhuǎn)變?yōu)閜Clamp10軟件可讀的文本文件，隨后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入pClamp10軟件，應(yīng)用其強(qiáng)大的波形數(shù)據(jù)分析功能對(duì)場(chǎng)電位幅度值進(jìn)行批量分析及輸出。

2.2 場(chǎng)電位信號(hào)

內(nèi)側(cè)前額葉-伏隔核通路中誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位見圖2。 圖2(a)所示為代表性刺激電流-場(chǎng)電位反應(yīng)曲線， 圖中灰色點(diǎn)幅度值對(duì)應(yīng)于內(nèi)圖中場(chǎng)電位波形， 刺激電流依次為0.4、 0.7、 0.8、 1.8、 2.0 mA； 場(chǎng)電位隨著刺激電流的增大而增加， 在刺激電流為1.8 mA時(shí)達(dá)到飽和。 圖2(b)所示為代表性場(chǎng)電位隨時(shí)間的變化(60 min)， 每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表5個(gè)連續(xù)記錄波形的疊加， 信號(hào)保持相對(duì)穩(wěn)定。 圖2(c)所示為重復(fù)方差分析結(jié)果，P=0.25顯示場(chǎng)電位隨時(shí)間并無(wú)顯著性變化， 表明該記錄系統(tǒng)平臺(tái)至少可以穩(wěn)定記錄信號(hào)1 h。 圖2(d)所示為代表性組織檢測(cè)圖， 在記錄過(guò)程中要保持麻醉水平及動(dòng)物體溫穩(wěn)定， 若二者發(fā)生變化，可引起信號(hào)的變化。

3 討論

本文中主要針對(duì)RM6240生物信號(hào)記錄系統(tǒng)在記錄誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位中的應(yīng)用，對(duì)RM6240系統(tǒng)中場(chǎng)電位信號(hào)數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行了改進(jìn)。研究結(jié)果顯示，RM6240系統(tǒng)可以記錄到內(nèi)側(cè)前額葉-伏隔核通路中誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位，且信號(hào)至少能夠穩(wěn)定地維持1 h。

本研究中應(yīng)用的電極是鎳鉻合金絲電極，除了這種材質(zhì)的電極外，玻璃電極、鉑銥合金絲電極以及鎢絲電極也常被用于電生理研究[9-11]。這些材質(zhì)的電極具有很好的組織(如腦組織)親和性，不易引起組織炎癥反應(yīng)。一般來(lái)講，玻璃電極易破碎，通常被用于麻醉狀態(tài)下的急性實(shí)驗(yàn)，而金屬電極則可以被埋植在動(dòng)物腦組織內(nèi)，適合于清醒自由活動(dòng)時(shí)的長(zhǎng)期或慢性實(shí)驗(yàn)[12-13]。另外，玻璃電極制作需要特定的設(shè)備儀器，而金屬絲電極制作相對(duì)簡(jiǎn)單。在具體應(yīng)用時(shí)應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)條件選擇合適的電極材料。

RM6240系統(tǒng)相比于國(guó)外的同類電生理儀器設(shè)備價(jià)格便宜，已在大學(xué)電生理教學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用，且方便搭建場(chǎng)電位記錄平臺(tái)，但是，該平臺(tái)仍然存在一些不足。1)該系統(tǒng)抗干擾能力差，需要放置在屏蔽箱中，限制了該系統(tǒng)應(yīng)用于清醒自由活動(dòng)條件下誘發(fā)場(chǎng)電位的記錄，尤其是與動(dòng)物行為的同步記錄。2)為了適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)程序要求，需要用到同步觸發(fā)功能，但是RM6240型系統(tǒng)對(duì)每一次刺激產(chǎn)生的場(chǎng)電位信號(hào)儲(chǔ)存為獨(dú)立子文件，為數(shù)據(jù)的批量分析帶來(lái)了挑戰(zhàn)。3)該系統(tǒng)本身的數(shù)據(jù)分析功能不完善，場(chǎng)電位幅值測(cè)量不夠靈活。鑒于后2點(diǎn)，本文中探索了用MATLAB批量處理由該系統(tǒng)導(dǎo)出的所有子文件(格式為文本文件.txt)，然后應(yīng)用pClamp10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，該方法具有可行性，進(jìn)而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析奠定了基礎(chǔ)。

如前言所述，內(nèi)側(cè)前額葉投射大量谷氨酸能纖維至伏隔核。Moussawi等[3]研究表明，刺激內(nèi)側(cè)前額葉時(shí)在伏隔核內(nèi)記錄的場(chǎng)電位是谷氨酸介導(dǎo)的興奮性突觸后電位，因此，通過(guò)記錄內(nèi)側(cè)前額葉-伏隔核場(chǎng)突觸后場(chǎng)電位，可以探測(cè)2個(gè)腦區(qū)間谷氨酸能突觸傳遞的狀態(tài)。另外，根據(jù)研究目的以及涉及的動(dòng)物行為模型，比如研究情緒相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶，該平臺(tái)可以被用來(lái)記錄基底外側(cè)杏仁核-伏隔核通路中誘發(fā)場(chǎng)突觸后電位，從而在環(huán)路水平上探究情緒相關(guān)學(xué)習(xí)記憶的內(nèi)在神經(jīng)機(jī)制[14-16]。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本文中應(yīng)用RM6240生物信號(hào)記錄系統(tǒng)以及自制的鎳鉻合金絲電極，記錄了內(nèi)側(cè)前額葉-伏隔核場(chǎng)突觸后場(chǎng)電位，信號(hào)至少能夠穩(wěn)定地維持1 h。另外，結(jié)合MATLAB和pClamp10軟件有效地解決了RM6240系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析的局限性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)建立了完善的數(shù)據(jù)分析框架。最后，盡管此平臺(tái)操作相對(duì)難度較大，但是能夠?yàn)楸究粕鷳?yīng)用RM6240系統(tǒng)開展誘發(fā)場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)提供參考，可用于提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作技能以及創(chuàng)造性思維能力。

致謝：非常感謝艾洪濱教授在撰稿過(guò)程中給予的指導(dǎo)和建議。