王鵬飛，劉培，葉花，王科，王嘉琛，段秀俊

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 榆次 030600）

風(fēng)濕寧膠囊由青風(fēng)藤、羌活、獨(dú)活、川芎等藥味組成，在治療風(fēng)寒濕邪，痹阻經(jīng)絡(luò)所致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等方面療效明顯。大孔樹(shù)脂現(xiàn)已廣泛用于天然藥物的分離與精制，近年來(lái)也逐步應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的工藝純化處理[1-2]，本實(shí)驗(yàn)主要探討大孔樹(shù)脂純化風(fēng)濕寧膠囊水提醇沉液的工藝條件，為風(fēng)濕寧膠囊的制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex高效液相色譜儀，PDA-100 Photodiode Array Detector檢測(cè)器，Chromeleon 6色譜工作站；Bs2245型分析天平，KQ-500型超聲波清洗儀，層析柱（Φ1.5 cm×30 cm）。

1.2 試藥

青藤堿對(duì)照品（批號(hào)：0774-200206，供含量測(cè)定用）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。大孔樹(shù)脂D101，購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；大孔樹(shù)脂NAK-9、X-5、HPD-100，購(gòu)自陜西樂(lè)博生化科技有限公司；大孔樹(shù)脂S-8，購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 青藤堿的測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[1-4]，取提取物約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%的甲醇溶液20 mL，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，制備供試品溶液。精密稱取干燥至恒重的青藤堿對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述兩種溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。

色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%三 胺（35∶65），檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm；柱溫30℃（見(jiàn)圖1）。

圖1 風(fēng)濕寧膠囊青藤堿測(cè)定液相色譜圖

2.2 大孔樹(shù)脂精制純化工藝條件的考察

2.2.1 樹(shù)脂的預(yù)處理 取新購(gòu)大孔吸附樹(shù)脂（D-101型、NKA-9型、S-8型、X-5型、HPD-100型），分別用95%乙醇浸泡數(shù)天后，依次用95%乙醇、純水、5%HCl，5%Na0H、純水沖洗備用[7-8]。

2.2.2 吸附條件考察

2.2.2.1 大孔樹(shù)脂的篩選 稱取處理好的5種型號(hào)樹(shù)脂各5 g，置100 mL錐形瓶中，加入藥液約70 mL，靜置24 h，不時(shí)振搖。將樹(shù)脂和藥液一起全部裝層析柱，藥液自然洗脫，收集所有洗脫液。測(cè)定吸附前后藥液中青藤堿含量，計(jì)算5種樹(shù)脂的吸附量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同型號(hào)樹(shù)脂飽和吸附量比較

結(jié)果表明，D-101型大孔樹(shù)脂的飽和吸附量最大，吸附性能最好，1 g樹(shù)脂可以吸附6.308 4 g的藥材，因此確定使用D-101型大孔樹(shù)脂。

2.2.2.2 上樣濃度的考察 取醇沉藥液，濃縮后分別用純水調(diào)至每1 mL藥液相當(dāng)于1 g原藥材的濃度，即1∶1，同法制得濃度為 3∶1，5∶1，7∶1的上樣液，分別上樣，控制流速為7 d·min－1，收集洗脫液，測(cè)定原液與洗脫液中青藤堿含量，計(jì)算4個(gè)濃度藥液的樹(shù)吸附量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 上樣濃度考察結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看藥液濃度為1∶1吸附效果最好。

2.2.2.3 上樣流速考察 固定上樣液的濃度為1∶1，分別以1、2、3、4 BV·h－1的流速上樣，收集洗脫液，測(cè)定原液與洗脫液中青藤堿含量，計(jì)算不同流速下的樹(shù)吸附量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同上樣流速吸附的考察

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，樹(shù)脂對(duì)青藤堿的吸附能力極強(qiáng)。1 BV·h－1的流速能夠得到最大的吸附量。

2.2.2.4 上樣量的確定（吸附量泄露的考察） 使用醇沉液配制100 mL一定濃度的上樣液，以1 BV·h－1的流速上樣已裝柱的經(jīng)處理的樹(shù)脂，每5 mL收集樣品一份。選擇第 1、4、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、20份洗脫液，各取 2 mL，用70%乙醇定容至25 mL，由0.45μL的濾頭過(guò)濾，取續(xù)濾液，進(jìn)行含量測(cè)定。以流出液的體積為橫坐標(biāo)，以指標(biāo)性成分的含量為縱坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 泄露曲線

由泄露曲線可得，從第9份樣品開(kāi)始泄露，飽和上樣量為45 mL，相當(dāng)于1g樹(shù)脂可吸附6.848 g的原藥材。

2.2.3 洗脫條件的考察

2.2.3.1 洗脫溶劑的選擇 取經(jīng)處理的樹(shù)脂4份，各5 g，考察不同洗脫劑濃度對(duì)洗脫的影響。將1∶1的上樣液以1 BV·h－1的流速上樣后，先用約100 mL的純水洗脫，水液棄去不用。再分別用濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫，收集洗脫液，調(diào)整濃度后，進(jìn)行含量測(cè)定。按公式（1）計(jì)算回收率[9-11]。結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 不同濃度洗脫劑的洗脫效果比較

由結(jié)果來(lái)看，50%乙醇的洗脫量最大，洗脫效果最好，確定使用。

2.2.3.2 洗脫流速的考察 用最佳吸附條件飽和吸附后，經(jīng)純水洗脫，相同體積的50%乙醇分別以1、3、4、5 BV·h－1的流速洗脫，收集洗脫液，對(duì)洗脫液中的青藤堿進(jìn)行測(cè)定，同2.2.3.1計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 洗脫流速的考察

從表5得出，隨著流速增大，洗脫效果降低，但 1 BV·h－1與 2 BV·h－1的洗脫流速對(duì)洗脫效果影響不大，但2 BV·h－1的洗脫流速可節(jié)約一半的時(shí)間，極大地提高了工作效率，所以選擇2 BV·h－1洗脫。

2.2.3 洗脫劑用量的考察 水洗飽和吸附的樹(shù)脂后，用100 mL的50%乙醇以1 BV·h－1洗脫，每10 mL收集一份，共收集約10份，制備供試液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算結(jié)果做曲線圖如圖3。

圖3 洗脫液中的含量變化

為保證洗脫完全，洗脫液的量定為10 BV。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照試驗(yàn)確定的吸附、洗脫的條件，進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定青藤堿的回收率，平均值為98.83%。

2.2.5 樹(shù)脂使用次數(shù)的考察 為節(jié)約生產(chǎn)成本考察了大孔樹(shù)脂不經(jīng)再生的重復(fù)使用次數(shù)，實(shí)驗(yàn)連續(xù)使用六次，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果樹(shù)脂在前五次使用時(shí)回收率均不低于98.44%，第六次使用時(shí)回收率顯著降低至91.90%，表明樹(shù)脂至少可以使用5次[12-13]。

表6 樹(shù)脂使用次數(shù)的考察

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要考察風(fēng)濕寧膠囊的大孔樹(shù)脂純化工藝條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明D-101型大孔樹(shù)脂對(duì)該制劑的吸附能力最強(qiáng)，上樣液濃度為1∶1，上樣流速為1 BV·h－1，上樣量為1 g樹(shù)脂折合原生藥6.848 g，洗脫溶劑為50%的乙醇，洗脫流速為2 BV·h－1，洗脫量為10 BV；樹(shù)脂至少可重復(fù)使用5次。

大孔樹(shù)脂多用于單味中藥的分離純化，風(fēng)濕寧膠囊由17味中藥組成，采用傳統(tǒng)的水提醇沉淀方法處理后服用量仍然較大，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將水提醇沉液進(jìn)行大孔樹(shù)脂純化處理，并對(duì)其純化工藝條件展開(kāi)了系統(tǒng)研究。項(xiàng)目組曾考察了水煎煮、水提醇沉、水提醇沉大孔樹(shù)脂處理三種工藝路線制備樣品的抗炎止痛效果，結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明不管是醇沉淀還是大孔樹(shù)脂吸附均未對(duì)藥效成分的提取量及藥效結(jié)果造成明顯影響，說(shuō)明風(fēng)濕寧膠囊采用大孔樹(shù)脂純化處理具有較強(qiáng)可行性。

風(fēng)濕寧膠囊雖然所含藥味較多，但多數(shù)藥味或因其所含成分水煎煮之后檢出率低，或在多味中藥中共存等，均不適于作為工藝考察的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)選擇了轉(zhuǎn)移率較高的青藤堿作為工藝考察指標(biāo)。

大孔樹(shù)脂純化是基于其吸附和篩選作用，洗脫較容易，因此用水或低體積分?jǐn)?shù)乙醇預(yù)洗除雜時(shí)應(yīng)考察其用量，以免目標(biāo)成分的損失。經(jīng)考察，風(fēng)濕寧膠囊采用10 BV純水預(yù)洗除雜基本未造成目標(biāo)成分的損失。