王元欣 岳康異 魚(yú)洋 武秀權(quán) 孫季冬 張磊*

(1扶風(fēng)縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 寶雞 722200; 2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

作為一種嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，帕金森病(Parkinson's disease, PD)的發(fā)病率越來(lái)越高，大量研究提示其發(fā)病主要與中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元代謝異常有關(guān)，但具體病理機(jī)制尚不清楚[1]。新近發(fā)現(xiàn)的線(xiàn)粒體表達(dá)分子沉默信息調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子3(silent information regulator transcription3, SIRT3)，在大腦等代謝活躍的組織高表達(dá)，是神經(jīng)元能量代謝和線(xiàn)粒體功能的中心環(huán)節(jié)，在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的聽(tīng)力減退、腫瘤及衰老等起著重要的細(xì)胞保護(hù)作用[2-3]，但其是否參與PD發(fā)生發(fā)展還有待研究。文獻(xiàn)報(bào)道，維生素C(vitamin C, Vit C)參與維持細(xì)胞正常能量代謝、拮抗氧化應(yīng)激、消除自由基等許多重要生理活動(dòng)[4-5]。但是，有關(guān)Vit C通過(guò)何種機(jī)制、能否有效治療PD的研究還較少見(jiàn)。腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株是一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化后，很接近中腦多巴胺能神經(jīng)元所合成的酶類(lèi)、表達(dá)的受體以及合成的神經(jīng)遞質(zhì)[6-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用PC12細(xì)胞系，建立1-甲基-4-苯基-四氫吡啶離子(1-methyl-4-phenyl 1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine, MPP+)致PD體外模型[8]，深入探討Vit C通過(guò)調(diào)控SIRT3影響PD細(xì)胞模型中PC12細(xì)胞自噬的作用機(jī)制，為Vit C在PD治療及作用機(jī)制方面研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑和細(xì)胞株

Vit C、MPP+(Sigma公司)，兔源一抗SIRT3、LC3B、β-actin(Abcam公司)，鼠源一抗LC3B(武漢三鷹)；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗(中杉金橋)；驢抗兔熒光二抗、驢抗鼠熒光二抗(Thermo公司)；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(cell counting Kit-8，CCK-8)由武漢博士德生物工程有限公司提供；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。PC12購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

二、PC12細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)和擴(kuò)增后，誘導(dǎo)其向交感神經(jīng)元樣細(xì)胞分化：取傳五代以上PC12細(xì)胞，經(jīng)消化分散后，制成5×105c/mL細(xì)胞懸液，接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

三、MPP+致PD體外模型的制作及分組

取形態(tài)類(lèi)似于交感神經(jīng)元的PC12細(xì)胞，對(duì)照組不做任何處理，Vit C組加入400 μmol/L Vit C孵育， Vit C+MPP+組加入400 μmol/L Vit C孵育6 h后加入700 μmol/L MPP+，MPP+組加入700 μmoL MPP+繼續(xù)孵育48 h，體外模擬帕金森病的神經(jīng)損傷。

四、CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力

96孔板以3 000 c/孔的密度接種PC12細(xì)胞，處理同上，每100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃下孵育1～4 h，酶標(biāo)儀法450 nm檢測(cè)吸光度。

五、LDH試劑盒檢測(cè)

按照說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm。以標(biāo)準(zhǔn)品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 U/L為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取上述4組細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)樣品吸光度值在該曲線(xiàn)圖上查出相應(yīng)LDH含量。

六、WB檢測(cè)LC3-Ⅱ和SIRT3表達(dá)

接種6孔板，分組及處理同上，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，和LC3B(1 ∶ 3 000)、SIRT3(1 ∶ 500)與β-actin(1 ∶ 3 000)抗體結(jié)合，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，壓片后顯色后照相。最后用Gel-Pro analyzer軟件進(jìn)行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對(duì)量。并進(jìn)行掃描圖像分析儀計(jì)算蛋白條帶的表達(dá)[9]。

七、免疫熒光檢測(cè)LC3-Ⅱ、SIRT3表達(dá)

用4%多聚甲醛固定20 min后，將爬片固定載玻片上，0.5 % tritonX-100 通透10 min，驢血清室溫封閉1 h，按比例加入鼠源一抗抗體(LC3 1 ∶ 50)、兔源一抗抗體(SIRT3 1 ∶ 400)，4 ℃過(guò)夜，驢抗兔熒光二抗抗體(1 ∶ 1 000)和驢抗鼠熒光二抗抗體(1 ∶ 1 000)室溫孵育3 h，洗滌后，Hoechst 染料染核10 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察后拍片。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PC12細(xì)胞CCK-8活力檢測(cè)

各組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力差異明顯(P<0.01)。單純Vit C組較對(duì)照組活力增加約5.88%，MPP+組細(xì)胞存活率為48.23%±0.33%，Vit C+MPP+組細(xì)胞存活率增高至63.97%±0.65%，兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 各組PC12細(xì)胞活力

Fig 1 Effect of Vit C on cell viability of MPP+-treated PC12 cells

aP<0.01,vsControl group;bP<0.01,vsMPP+group.

二、PC12細(xì)胞LDH檢測(cè)結(jié)果

MPP+組與Vit C+MPP+組中LDH含量差異明顯(P<0.01)。而與MPP+組LDH含量比較(165.200±5.946)U/L相比，Vit C+MPP+組PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量(130.400±6.589)U/L減少，兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組LDH檢測(cè)

Fig 2 LDH activity in each group

aP<0.01,vsControl group;bP<0.01,vsMPP+group.

三、WB檢測(cè)PC12細(xì)胞LC3-Ⅱ和SIRT3表達(dá)的變化

對(duì)照組和Vit C組中LC3-Ⅱ、SIRT3少量表達(dá)，之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與MPP+組比較，Vit C + MPP+組SIRT3和自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ表達(dá)顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

四、免疫熒光檢測(cè)PC12細(xì)胞LC3-Ⅱ和SIRT3表達(dá)的結(jié)果

對(duì)照組中LC3-Ⅱ、SIRT3少量表達(dá)。與MPP+組比較，Vit C+MPP+組中中自噬相關(guān)分LC3-Ⅱ點(diǎn)狀熒光表達(dá)增多、增強(qiáng)，SIRT3表達(dá)亦成斑點(diǎn)狀、熒光強(qiáng)度顯著增高，見(jiàn)圖4。

圖3 Western Blot檢測(cè)LC3-Ⅱ和SIRT3蛋白在各組中的表達(dá)變化

Fig 3 The expression of LC3-Ⅱand SIRT3 protein in each group detected by Western Blot

A: Statistical representation for the expression of LC3-II; B: Statistical representation for the expression of SIRT3.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsMPP+group.

圖4 熒光顯微鏡檢測(cè)LC3-Ⅱ、SIRT3的表達(dá)(×400)

Fig 4 LC3-Ⅱand SIRT3 in of MPP+treated PC12 cell detected by immunofluorescense microscopy (×400)

討 論

最新研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和自我“清除”功能退化等多因素病因與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是PD發(fā)病的核心機(jī)制。首先，Xu等[10]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-Nrf2被調(diào)控線(xiàn)粒體自噬的DJ-1蛋白抑制，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用；而一些對(duì)多巴胺能神經(jīng)元起神經(jīng)保護(hù)作用的分子，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸[11]。其次，在人類(lèi)和動(dòng)物，線(xiàn)粒體復(fù)合物I抑制劑可導(dǎo)致PD，Alvarez-Erviti等發(fā)現(xiàn)PD患者的黑質(zhì)和杏仁核線(xiàn)粒體自噬功能有缺陷或退化[12]。而過(guò)度的線(xiàn)粒體應(yīng)激或PINK1/2基因突變患者容易發(fā)生線(xiàn)粒體損傷累積，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和毒素累積損傷增加，引起多巴胺能神經(jīng)元死亡繼而引發(fā)PD[13]。綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)和線(xiàn)粒體自噬在PD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但具體分子病理機(jī)制仍不明確。

SIRT3主要位于線(xiàn)粒體，在大腦等代謝活躍的組織高表達(dá)，是神經(jīng)元能量代謝和線(xiàn)粒體功能的中心環(huán)節(jié)[14]。本研究中，Vit C在上調(diào)SIRT3的同時(shí)，也影響自噬相關(guān)分子LC3-Ⅱ的表達(dá)，增加PC12細(xì)胞自噬的發(fā)生，提示SIRT3和LC3-Ⅱ在表達(dá)上存在正相關(guān)，但具體作用機(jī)制還有待更深入研究。

Vit C是一種廣譜抗氧化物，Engelhart等[15]通過(guò)大樣本調(diào)查，發(fā)現(xiàn)Vit C可以顯著減低癡呆癥的患病率，但其具體機(jī)制甚不明了。后來(lái)Berzina[16]等發(fā)現(xiàn)，Vit C可拮抗炎癥反應(yīng)，還能維持氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而發(fā)揮治療雞腸膜炎作用。而本研究的CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)和LDH含量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Vit C可以增強(qiáng)細(xì)胞自身活力，顯著降低LDH漏出率，且具有較好的減輕損傷，保護(hù)PC12細(xì)胞的作用。Western-Blot檢測(cè)LC3-Ⅱ的結(jié)果提示我們MPP+損傷可激活細(xì)胞自噬水平，但PC12細(xì)胞死亡增加，提示MPP+可能通過(guò)另外信號(hào)通路損傷神經(jīng)細(xì)胞，而其激活的細(xì)胞自噬等功能活動(dòng)不足以阻止其損傷作用，從而造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷，而加入Vit C后，進(jìn)一步提高PC12細(xì)胞的自噬水平，達(dá)到清除損傷因素，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞維持正常生理功能，拮抗PD的神經(jīng)損傷；深入研究發(fā)現(xiàn)，Vit C亦可能通過(guò)顯著增加SIRT3表達(dá)，減輕MPP+損傷后的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而免疫熒光結(jié)果顯示，在MPP+損傷后SIRT3和LC3-ⅡC存在共定位，Vit C可以顯著提高兩者表達(dá)。鑒于SIRT3在PD模型中有保護(hù)神經(jīng)元的作用[17]，而Vit C可以激活SIRT3和提高細(xì)胞自噬水平，抑制細(xì)胞損傷，表明兩者在拮抗PD的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要保護(hù)作用。在下一步實(shí)驗(yàn)中，我們將通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)和下調(diào)SIRT3表達(dá)，以期闡明VitC如何通過(guò)調(diào)控SIRT3影響細(xì)胞自噬水平的分子信號(hào)機(jī)制。