王蕾 張毅 王旭東 葉子

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院:1急診中心; 2神經(jīng)外科; 3中醫(yī)科，江蘇 南通 226001)

顱內(nèi)感染、腫瘤、顱腦外傷、眼部病變等常出現(xiàn)導(dǎo)致展神經(jīng)損傷，損傷后局部微環(huán)境代謝復(fù)雜，而神經(jīng)細(xì)胞高度分化、再生能力低，影響了患者的生活質(zhì)量[1]。迄今尚缺乏促進(jìn)其功能修復(fù)的有效措施，顯微外科手術(shù)修復(fù)不盡滿意，相關(guān)的基礎(chǔ)研究目前也存在異議。針對病因治療外，電針刺激是一種較好的康復(fù)治療方法[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞，在傷害性應(yīng)激狀態(tài)下迅速反應(yīng)，釋放大量的細(xì)胞因子，而研究得出炎癥反應(yīng)是影響神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)的關(guān)鍵[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞在不同的微環(huán)境中可以出現(xiàn)不同的細(xì)胞表型：M1型與M2型。在神經(jīng)細(xì)胞損傷后可激化為M1型，誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，但過多的炎癥反應(yīng)因子同時也會導(dǎo)致正常細(xì)胞的損傷及凋亡[4]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞主要抑制機(jī)體過度的免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥修復(fù)，保證神經(jīng)修復(fù)與再生[5]。故抑制炎癥刺激對神經(jīng)細(xì)胞的過度打擊，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1型與M2型動態(tài)平衡成為神經(jīng)功能保護(hù)作用機(jī)制的焦點(diǎn)?；谝陨媳尘?，本實(shí)驗(yàn)以電針刺激為核心，利用小膠質(zhì)細(xì)胞為切入點(diǎn)，采用Western Blot技術(shù)明確展神經(jīng)中M1、M2型標(biāo)志分子的表達(dá)，進(jìn)一步探討電針刺激展神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對象

選用健康Beagle犬(6月齡,n=36)，雌雄各半，體重(15.0±0.5) kg，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號SCXK(蘇):2008-0010。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于單獨(dú)的犬房，可自由走動，保證適宜的溫度進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2 w進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為3組，每組12只：假手術(shù)組(A)、損傷組(B)和電針處理組(C)。實(shí)驗(yàn)動物治療4 w取材進(jìn)行Western Blot檢測展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2型標(biāo)志分子的表達(dá)水平。動物的處理遵守國家健康協(xié)會制定的實(shí)驗(yàn)動物使用指南。實(shí)驗(yàn)分組：假手術(shù)組(A)：Beagle犬麻醉后，僅暴露分離展神經(jīng)，術(shù)中不進(jìn)行神經(jīng)損傷處理，縫合切口皮膚，在電針刺激時進(jìn)行束縛，連續(xù)2 w，每次持續(xù)15 min。損傷組(B)：Beagle犬麻醉后，制作展神經(jīng)損傷模型，在電針刺激時進(jìn)行束縛，連續(xù)2 w，每次持續(xù)15 min。電針處理組(C)：12只Beagle犬展神經(jīng)損傷模型建立后進(jìn)行電針刺激，每次持續(xù)15 min連續(xù)2 w。參數(shù)設(shè)置：刺激脈沖頻率 5 Hz，時程 0.1 ms，刺激強(qiáng)度 1.0 V。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 展神經(jīng)損傷動物模型制作：術(shù)前12 h禁食后注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈麻醉。將Beagle犬置于手術(shù)臺進(jìn)行側(cè)臥位，固定試驗(yàn)動物頭顱，耳緣牽向尾側(cè)固定，麻醉充分開顱后皮瓣翻向外側(cè)切除大腦半球，保留中腦組織，經(jīng)顳肌附著處縱向切開。經(jīng)顳底入路開顱，骨窗盡量靠近顱底，擴(kuò)大骨窗范圍從眶后到顴弓前，并沿顳骨窗下緣切開硬腦膜沿斜坡向上外方做一創(chuàng)口約3.5 cm×3.5 cm。經(jīng)巖顳韌帶下方進(jìn)入海綿竇充分暴露深部的展神經(jīng)。用有齒止血鉗擠壓夾閉展神經(jīng)30 s后直視鉗壓處組織菲薄，切斷展神經(jīng)軸突但維持神經(jīng)鞘膜完性，以犬眼球呈內(nèi)斜視表明造模成功。

2. 電針刺激：C組展神經(jīng)損傷模型制完成后將2個電極(5F導(dǎo)管)分別置入神經(jīng)損傷處兩側(cè)。向外方牽拉上下眼瞼，在瞼板與球結(jié)膜交界處充分暴露外直肌，將電極均插入外直肌，植入深度約3.0 mm，間距約4.0 mm，縫合切口固定電極。游離端自眼眶后下方引出固定，形成回路，術(shù)后連續(xù)2 w給予電針刺激，每次持續(xù)15 min。參數(shù)設(shè)置：脈沖頻率為5 Hz，時程 0.1 ms，強(qiáng)度1.0 V。A及B組僅束縛，不刺激。

3. Western Blot檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的M1、M2分子表達(dá)：取上述Beagle犬各分組每組12只，用10%水合氯醛進(jìn)行深度麻醉后，迅速用手術(shù)剪剪下展神經(jīng)節(jié)段，在低溫?zé)o菌冰盤上進(jìn)行操作，分離出少許神經(jīng)組織置于1 mL勻漿器球狀部位，盡量充分剪碎組織。加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的400 μL單去污劑裂解液裂進(jìn)行勻漿。裂解30 min后在4 ℃下12 000 rpm離心10 min，取上清分裝置于-20 ℃保存。提取小膠質(zhì)細(xì)胞的總蛋白，通過NanoDrop定量，取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, SDS-PAGE)電泳，將蛋白以恒定電流30 mA，電轉(zhuǎn)90 min轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，TBST洗膜3次，然后5%TBST脫脂奶粉的以60 rpm的速度封閉60 min，加入一抗4 ℃冰箱孵育過夜(一抗的濃度：白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)為1 ∶ 200，誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)為1 ∶ 3 000，精氨酸(arginase)為1 ∶ 1 000，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)為1 ∶ 200，一抗孵育完成后TBST漂洗3次，再移至新雜交袋中，與熒光標(biāo)記二抗(1 ∶ 20 000)常溫孵育60 min，TBST充分清洗后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)顯影并拍照，進(jìn)行條帶灰度分析。

三、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、Beagle犬展神經(jīng)電刺激損傷模型建立

Beagle犬展神經(jīng)暴露清楚(箭頭所示)，術(shù)后均生存良好，無感染、角膜潰瘍等并發(fā)癥，展神經(jīng)損傷后，犬眼球呈內(nèi)斜視(圖1、2)。

二、Western Blot 結(jié)果

將三組實(shí)驗(yàn)動物治療4 w取材進(jìn)行Western Blot檢測展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2型標(biāo)志分子的表達(dá)水平。

B組的iNOS的表達(dá)較A組比較增加(P<0.05)，C組的iNOS與A組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；其中與B組相比，C組iNOS降低(P<0.05)；同時B、C組的IL-1β的表達(dá)較A組比較均增加(P<0.05)，其中與B組相比，C組IL-1β降低(P<0.05)。而與A組相比，B、C組Arginase表達(dá)均增加(P<0.05)，其中C組的Arginase較B組表達(dá)增加(P<0.05)，BDNF在B、C組的表達(dá)均增加(P<0.05)，C組的BDNF較B組表達(dá)增加(圖3)。

圖1 Beagle犬展神經(jīng)

Fig 1 Nerve of Beagle dog model

圖2 展神經(jīng)損傷后眼球位置

Fig 2 The position of the eyeball after nerve injury

圖3 電針刺激對小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2型標(biāo)志分子表達(dá)

Fig 3 Expression of M1 and M2 marker molecules on microglia stimulated by electroacupuncture

表1 電針刺激對小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2型標(biāo)志分子表達(dá)比較

Tab 1 Comparison of electroacupuncture stimulation on expression of M1 and M2 type markers in microglia

GroupiNOSIL-1βArginaseBDNF Group A0.11±0.930.02±1.290.25±1.140.05±1.08 Group B0.31±0.89a0.09±1.15a0.38±1.03a0.49±0.78a Group C0.14±1.01b0.05±0.91ab0.67±0.89ab0.82±0.68ab

Note:aP<0.05,vsGroup A;bP<0.05,vsGroup B.

討 論

外展神經(jīng)損傷病因較為復(fù)雜，由多種因素導(dǎo)致支配神經(jīng)受損引起眼球運(yùn)動受限。目前的顯微外科手術(shù)治療展神經(jīng)損傷的臨床療效有了較高的進(jìn)步，但對于嚴(yán)重神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)仍不是滿意的解決方案。而針刺的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，電針刺激神經(jīng)損傷有效地提高受損神經(jīng)功能恢復(fù)率[6]。通過減輕損傷細(xì)胞炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善代謝微環(huán)境，調(diào)節(jié)炎性因子釋放，從而促進(jìn)神經(jīng)再生、阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7]。目前較多學(xué)者在針刺治療周圍神經(jīng)損傷的研究主要集中在面神經(jīng)和坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)，在動眼神經(jīng)損傷修復(fù)亦有相關(guān)研究。同時利用電針刺激外展神經(jīng)麻痹亦取得了較好的療效，但關(guān)于針刺促進(jìn)外展神經(jīng)修復(fù)機(jī)制研究較少。

當(dāng)內(nèi)環(huán)境細(xì)胞因子水平的改變、侵染病原體的類型、刺激的強(qiáng)度與時間等應(yīng)激狀態(tài)出現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞最先啟動免疫反應(yīng)。通過產(chǎn)生一系列的免疫受體：①Toll樣受體(toll like receptors, TLRs)能夠使缺血性損傷惡化，但是缺血性損傷前TLRs短暫激活卻能降低繼發(fā)損傷[8]；②核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domains, NODs)、NOD樣受體和多種清道夫受體等，對于神經(jīng)元凋亡及認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，目前主要研究于阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)，同時產(chǎn)生多種炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和多種趨化因子[9]，表現(xiàn)為M1型。有研究表明M1型小膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)鍵性標(biāo)記物為iNOS。iNOS能夠利用精氨酸產(chǎn)生NO，與過氧化物反應(yīng)形成過氧亞硝基陰離子，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[10]。在消滅病原體的同時，還通過氧化應(yīng)激反應(yīng)釋放氮基團(tuán)與活性氧自由基對神經(jīng)元起到強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性作用[11]。而IL-1β與IL-1受體結(jié)合后，激活NF-κB通路促進(jìn)炎癥發(fā)生[12]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞能誘發(fā)一系列的抗氧化反應(yīng)，上調(diào)血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)表達(dá)，抑制缺血后活性氧產(chǎn)生[13]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞還能夠通過IL-10發(fā)揮負(fù)反饋?zhàn)饔?，抑制促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α產(chǎn)生，上調(diào)神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)表達(dá)，抑制Caspase-3活性，減少神經(jīng)元死亡[14]。新生神經(jīng)元的存活易受微環(huán)境的影響。小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過P2X4R釋放BDNF，促進(jìn)新生神經(jīng)元存活[15]。Arginase和Ym1能預(yù)防細(xì)胞外基質(zhì)降解[16]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞能夠去除異常的突觸，促進(jìn)功能性突觸形成而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

我們課題組在前期研究中已經(jīng)成功建立Beagle犬展神經(jīng)損傷的動物模型，通過顳底入路，術(shù)后試驗(yàn)動物生存較滿意，無嚴(yán)重感染、癲癇等危重并發(fā)癥，除展神經(jīng)損傷所致的眼球運(yùn)動障礙外，未觀察到合并其它神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)[18]。建模成功后用電針刺激展神經(jīng)，術(shù)后4 w開始Beagle犬的瞳孔中心至外眥內(nèi)側(cè)緣距離明顯縮小，外直肌功能開始恢復(fù)，認(rèn)為電針刺激可以明顯促進(jìn)損傷的展神經(jīng)恢復(fù)[19]，我們猜測4 w是展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型轉(zhuǎn)化為M2型進(jìn)行活化的關(guān)鍵時刻。通過Western Blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)C組M1型標(biāo)志分子iNOS和IL-1β的表達(dá)較B組顯著降低，表明電針刺激能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化為M1型。而C組Arginase和BDNF表達(dá)較B組增多，電針刺激能夠顯著升高M(jìn)2型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，我們的研究從切斷展神經(jīng)軸突作為損傷因素，通過觀察電針刺激后其對小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。但是試驗(yàn)中我們保持神經(jīng)鞘膜完性，保留了神經(jīng)電活動的傳導(dǎo)連續(xù)性，而小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)是受多種因素綜合影響的，包括應(yīng)激因素的種類、程度、時間等，包括活化過程依賴的細(xì)胞種類，接受神經(jīng)元損傷程度的信號程度等，值得我們繼續(xù)深入研究。