KANG BO KYOUNG 陳維明 周廣東 曹德君

目前，基于軟骨細(xì)胞的軟骨組織構(gòu)建及缺損修復(fù)已在多種動物體內(nèi)獲得成功，但尚未能夠成功應(yīng)用于臨床，重要的原因之一就是種子細(xì)胞來源存在問題[1-2]。自體軟骨細(xì)胞仍是目前軟骨再生的重要種子細(xì)胞來源，但自體軟骨細(xì)胞來源有限，取材會造成新的創(chuàng)傷，體外擴(kuò)增后易老化和去分化并喪失軟骨再生能力。因此，以具有多向分化能力的干細(xì)胞為種子細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)[3]。但本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，BMSC體外構(gòu)建的軟骨在皮下環(huán)境極易發(fā)生血管化、骨化，最終導(dǎo)致軟骨再生失敗，不利于在非關(guān)節(jié)環(huán)境中的應(yīng)用（如耳、鼻、氣管等部位）[4]。Pelttari等[5]發(fā)現(xiàn)，血管化是影響B(tài)MSC體內(nèi)軟骨再生穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。發(fā)育生物學(xué)研究證實(shí)，軟骨內(nèi)骨化的關(guān)鍵啟動因素是血管化。因此，抑制血管化是提高BMSC體內(nèi)軟骨再生穩(wěn)定性的關(guān)鍵[4-9]。

姜黃素是最早由Pelletier等[5]從姜黃的根莖中分離得到的一種酚類天然藥物，因其抗腫瘤譜廣，不良反應(yīng)小，美國國立腫瘤研究所已將其列為第3代腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物[10]。大量研究證明，姜黃素具有廣泛的生理活性作用，不但能保護(hù)受損的正常細(xì)胞，也能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[10-16]。姜黃素具有抗腫瘤血管生成作用，可通過抑制VEGF及其對應(yīng)受體，明顯抑制荷瘤小鼠艾氏腹水癌模型實(shí)體腫瘤的血管形成，說明姜黃素是一種特異性血管生成抑制劑[11-12]。但能否應(yīng)用負(fù)載姜黃素的支架材料，在動物皮下環(huán)境中構(gòu)建軟骨未見相關(guān)報道。

應(yīng)用負(fù)載姜黃素的支架材料進(jìn)行軟骨再生構(gòu)建，其主要難點(diǎn)是如何有效地負(fù)載姜黃素并實(shí)現(xiàn)緩釋作用。因?yàn)榻S素是非水溶性的物質(zhì)，材料制備過程中，將其均勻地分散到材料中并實(shí)現(xiàn)緩釋，是一個難題。電紡膜可通過油劑溶劑進(jìn)行制作，并與溶脂性藥物均相混合。姜黃素可以溶解到該體系中，隨著材料的降解逐漸釋放。因此，本研究采用電紡膜方式制備支架，以明膠支架作為載體來負(fù)載姜黃素。姜黃素均勻分散到整個電紡纖維膜上，并隨著明膠材料的緩慢降解，逐步釋放姜黃素以實(shí)現(xiàn)載藥緩釋的目的。

本研究的主要目標(biāo)是證明負(fù)載姜黃素的支架材料能否用于軟骨再生。因?yàn)楦杉?xì)胞誘導(dǎo)軟骨再生過程中，有很多復(fù)雜的影響因素。所以本研究首先以軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

新西蘭大白兔5只（甲干生物有限公司），雌雄不限，體質(zhì)量4～5 Kg；裸鼠30只（中科院動物所），雌雄不限。按照動物實(shí)驗(yàn)保護(hù)指南進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclon公司，美國），Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國），胰蛋白酶（Hyclone 公司，美國），姜黃素（百靈威試劑公司），明膠（阿拉丁試劑公司）。

1.3 種子細(xì)胞的獲取與擴(kuò)增

剪取兔耳軟骨，洗凈，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入5倍體積的0.25%膠原酶搖床消化過夜；75 μm 孔徑濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min 離心 5 min，PBS漂洗2遍，以含10%FBS的高糖DMEM配成細(xì)胞懸液，按2×106個/皿（直徑10 cm培養(yǎng)皿）接種細(xì)胞，置入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)[1-2]。細(xì)胞達(dá)90%融合時進(jìn)行傳代[17]。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第2代軟骨細(xì)胞。

1.4 材料的制備及分組

將Gelatin溶于六氟異丙醇中，質(zhì)量體積比12%（w/v）。PLA 溶于六氟異丙醇中，質(zhì)量體積比 8%（w/v）。Gelatin溶液與PLA溶液按照10∶3的體積比混合，靜電紡絲。紡絲參數(shù)：電壓15 KV，推進(jìn)速度3 mL/h，接受距離15 cm。EDC/NHS交聯(lián)溶液配制：0.5 g EDC和0.3 g NHS溶于100 mL的95%乙醇中。將納米纖維膜浸泡于交聯(lián)液中12 h，去離子水沖洗，冷凍干燥。姜黃素溶液配制：將2 mg姜黃素溶于乙醇中（含5%冰醋酸），將納米纖維膜浸泡于姜黃素溶液中2 h，去離子水沖洗，冷凍干燥。

單純明膠納米纖維電紡膜為對照組，明膠/姜黃素納米纖維電紡膜為實(shí)驗(yàn)組。取對照組、實(shí)驗(yàn)組材料分別植入BALB/c裸鼠背部皮下，每組各2只，6周后取材行大體觀察。

1.5 細(xì)胞-支架復(fù)合物的制備

用直徑5 mm的角膜環(huán)鉆將明膠納米纖維電紡膜（對照組）和明膠/姜黃素納米纖維電紡膜（實(shí)驗(yàn)組）處理成直徑5 mm的圓形膜片，環(huán)氧消毒處理，紫外線消毒30min備用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果，用“三明治”法構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合物[1-2，4]。 將第2代軟骨細(xì)胞用培養(yǎng)液制備成100×106cells/mL濃度的細(xì)胞混懸液，用顯微鑷將納米纖維電紡膜按照“電紡膜-細(xì)胞懸液-電紡膜”的方式疊加，每層約加入6 μL細(xì)胞懸液，共疊加6層；在 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min后，小心加入含10%FBS的高糖DMEM至覆蓋復(fù)合物后繼續(xù)培養(yǎng)。每3日換液一次[1-2，4]。

1.6 掃描電鏡觀察

單純材料：將明膠納米纖維電紡膜（對照組）和明膠/姜黃素納米纖維電紡膜（實(shí)驗(yàn)組）用剪刀剪切成小片（半圓形，直徑5 mm），導(dǎo)電膠固定，噴金，在10 KV的加速電壓下，掃描電鏡觀察靜電紡納米纖維的形貌[2]。每個試樣取3個平行樣品。

細(xì)胞-支架復(fù)合物：消化收集軟骨細(xì)胞，將直徑5 mm的明膠納米纖維電紡膜（對照組）和明膠/姜黃素納米纖維電紡膜（實(shí)驗(yàn)組）放入24孔板內(nèi)，加入濃度為100×106cells/mL的軟骨細(xì)胞至覆蓋復(fù)合物，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，復(fù)合物取出后2.5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

1.7 細(xì)胞增殖率檢測

將環(huán)氧乙烷消毒的直徑5 mm的圓形膜片放入24孔板中，加入6 μL濃度100×106cells/mL的軟骨細(xì)胞懸液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，40 min后小心加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液至覆蓋復(fù)合物后繼續(xù)培養(yǎng)。分別于第2、4、6、8天，向?qū)φ战M和實(shí)驗(yàn)組每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育。4 h后將24孔板里的溶液輕輕吸除，移到96孔板中，多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度[1-2，4]。

1.8 組織學(xué)檢測

取兔耳軟骨細(xì)胞，接種于單純明膠支架 （對照組）及相同規(guī)格的姜黃素/明膠支架（實(shí)驗(yàn)組），體外培養(yǎng)1周后分別植入BALB/c裸鼠背部皮下左右兩側(cè)（左側(cè)對照組，右側(cè)實(shí)驗(yàn)組）。分別于植入后3周、12周時取出，行組織學(xué)檢測（HE、番紅O-固綠、Ⅱ型膠原免疫組化染色）[1-2，4]。

2 結(jié)果

2.1 材料形貌觀察

SEM顯示對照組電紡膜纖維分布較密集，孔隙比較?。粚?shí)驗(yàn)組電紡膜纖維相比對照組略稀疏、孔隙較大（圖 1）。

2.2 電鏡下細(xì)胞在支架上的黏附情況

軟骨細(xì)胞接種于兩組支架材料2周后進(jìn)行SEM觀察，結(jié)果顯示，兩組支架材料上細(xì)胞分布均勻，黏附良好，均顯示出良好的細(xì)胞相容性，但對照組材料表面細(xì)胞黏附程度略差于實(shí)驗(yàn)組（圖2）。

2.3 細(xì)胞-支架復(fù)合物的細(xì)胞增殖率檢測

用CCK-8試劑盒進(jìn)行體外培養(yǎng)細(xì)胞-支架復(fù)合物的細(xì)胞增殖率檢測，結(jié)果顯示，對照組第3天生長曲線下降明顯，第4天開始上升；實(shí)驗(yàn)組第3天生長曲線略有下降，第6天開始慢慢上升。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力相比對照組略有下降，但無顯著影響（圖3）。

2.4 單純材料皮下植入后大體觀察

復(fù)合物皮下植入6周后行大體觀察，結(jié)果顯示，對照組有明顯的血管化現(xiàn)象，而負(fù)載姜黃素的實(shí)驗(yàn)組周圍血管化受到明顯抑制，提示姜黃素具有明顯的血管抑制作用（圖4）。

2.5 細(xì)胞-支架復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建的大體觀察

復(fù)合物體外培養(yǎng)1周后植入裸鼠皮下，體內(nèi)培養(yǎng)3周、12周時，兩組均形成了具有一定彈性的軟骨樣組織，直徑、大小無明顯改變，但隨著體內(nèi)培養(yǎng)時間延長，“三明治”式復(fù)合物的形態(tài)有所破壞。從外觀上看，3周、12周時實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本均呈現(xiàn)淡黃色外觀，提示姜黃素的緩釋時間可持續(xù)12周以上（圖5）。

2.6 細(xì)胞-支架復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建的組織學(xué)觀察

組織學(xué)顯示，3周、12周時兩組均有軟骨陷窩形成。體內(nèi)培養(yǎng)3周，實(shí)驗(yàn)組軟骨陷窩形成較對照組更為明顯；體內(nèi)培養(yǎng)12周時，兩組均有成熟的軟骨陷窩形成，組間明顯差異，提示負(fù)載姜黃素未對皮下環(huán)境的軟骨再生產(chǎn)生明顯的不良影響（圖6-7）。

圖1 兩組支架大體與電鏡觀察Fig.1 Gross view and SEM observation of the two groups

圖2 兩組復(fù)合物大體觀與電鏡觀察Fig.2 Gross view and SEM observation of the cell-scaffold complex in the two groups

圖3 兩組復(fù)合物的細(xì)胞生長曲線Fig.3 Growth curve of the chondrocyts in the two groups

圖4 單純材料皮下植入后大體觀察Fig.4 Gross observation of material after subcutaneous implantation

圖5 細(xì)胞-支架復(fù)合物體外、體內(nèi)構(gòu)建的大體觀察Fig.5 Gross view of the cell-scaffold complex cultured in vitro and in vivo

圖6 體內(nèi)培養(yǎng)3周組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：500 μm）Fig.6 Histological observation in each group after cultured for 3 weeks in vivo(scale bars:500 μm)

圖7 體內(nèi)培養(yǎng)12周各組組織學(xué)觀察（標(biāo)尺：500 μm）Fig.7 Histological observation in each group after cultured for 12 weeks in vivo(scale bars:500 μm)

3 討論

目前，BMSC體外構(gòu)建軟骨在皮下環(huán)境中異位骨化是公認(rèn)的難題。一般認(rèn)為，異位骨化主要與血管化有關(guān)。因此，解決此難題的關(guān)鍵在于抑制血管化。

相關(guān)文獻(xiàn)表明，姜黃素具有抗腫瘤血管生成作用，可通過抑制VEGF及其對應(yīng)受體，明顯抑制荷瘤小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞形成實(shí)體腫瘤的血管，說明姜黃素是一種特異性血管生成抑制劑[11-12]。組織工程研究中，使用軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建的軟骨樣組織植入皮下后可以形成穩(wěn)定的軟骨，很少發(fā)生骨化。但是，利用BMSC體外構(gòu)建的軟骨植入皮下后，卻極易發(fā)生血管侵入和基質(zhì)鈣鹽沉積，不能形成穩(wěn)定的軟骨組織。皮下環(huán)境不利于BMSC誘導(dǎo)的軟骨生長，而且單純BMSC誘導(dǎo)的軟骨植入皮下后，其產(chǎn)生的抗血管化因子不足以抵抗皮下環(huán)境中的促血管化因子，造成失衡。但是，能否利用姜黃素抑制血管化來調(diào)控干細(xì)胞的異位骨化，目前沒有相關(guān)的報道。本研究擬說明3個問題：其一，如何實(shí)現(xiàn)姜黃素的持久緩釋；其二，姜黃素是否在體內(nèi)環(huán)境中具有血管抑制作用；其三，負(fù)載姜黃素的支架是否適合軟骨再生。

本研究表明，①姜黃素是非水溶性的物質(zhì)，可采用電紡膜技術(shù)通過油劑溶劑將姜黃素均勻地分散至材料中，負(fù)載姜黃素的電紡膜支架材料通過材料的緩慢降解，逐步地釋放姜黃素，以達(dá)到持久緩釋的目的。本實(shí)驗(yàn)中，負(fù)載姜黃素的電紡膜支架材料體內(nèi)植入12周內(nèi)，淡黃色一直存在,說明姜黃素的緩釋時間可以持續(xù)12周以上。②本研究將兩種復(fù)合物植入裸鼠皮下后行大體觀察。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組觀察到明顯的血管抑制現(xiàn)象，這對于后期進(jìn)一步研究姜黃素通過抑制血管化來調(diào)控干細(xì)胞的異位骨化至關(guān)重要。③考慮到干細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨再生過程中有很多復(fù)雜的影響因素，本研究首先以軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討姜黃素應(yīng)用于皮下軟骨細(xì)胞再生的可行性。電鏡觀察顯示，負(fù)載姜黃素以后，材料細(xì)胞分布均勻，黏附良好，顯示出良好的細(xì)胞相容性；細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力相比對照組略有下降，但影響不明顯。組織學(xué)觀察顯示，3周、12周時兩組復(fù)合物均有軟骨陷窩形成，無明顯差異，提示負(fù)載姜黃素未對皮下環(huán)境的軟骨再生形成明顯的不良影響。

本研究表明，姜黃素對軟骨細(xì)胞生長無害，皮下環(huán)境下藥物降解速度緩慢，不引起炎癥反應(yīng)，對軟骨細(xì)胞無明顯破壞。本研究結(jié)果對于未來應(yīng)用姜黃素參與BMSC軟骨構(gòu)建，提供了重要的支持。

4 結(jié)論

通過電紡纖維技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)姜黃素的持久緩釋，姜黃素具有明顯的血管抑制作用，而且負(fù)載姜黃素支架對軟骨再生無明顯不良影響。明膠/姜黃素材料可作為支架在動物皮下構(gòu)建組織工程化軟骨組織，是一種具有潛在應(yīng)用前景的支架材料。