張麗娟，王 珍，廖尚高

(1. 貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2. 貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

太子參[Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax]為石竹科孩兒參屬植物孩兒參[Pseudostellariaheterophylla]的干燥塊根，收采于貴州黔東南施秉縣，具有益氣健脾，生津潤肺的功效，用于脾虛體倦，食欲不振，病后虛弱，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳[1]，目前已被衛(wèi)生部列入可用于保健食品的中藥材名單[2]。對太子參的化學(xué)成分研究表明[3]，太子參含有微量元素、氨基酸、多糖、核苷、磷脂、環(huán)肽、脂肪酸等多種成分，其中多糖是太子參的主要活性成分之一，具有心肌保護(hù)、抗疲勞、抗氧化、抗應(yīng)激、降血糖、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性[3-6]。

植物多糖的免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過激活T /B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷( NK) 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放；促進(jìn)抗體的生成；激活補(bǔ)體系統(tǒng)等而發(fā)揮作用的[7-8]。巨噬細(xì)胞是宿主天然免疫防御陣線的重要成員，激活的巨噬細(xì)胞可以通過吞噬作用殺傷病原微生物，抑制許多腫瘤細(xì)胞的生長[7, 9]，如通過分泌 TNF-α、IL-1、IL-6、GM-CSF 和 NO 等免疫活性分子，與效應(yīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞間的信息傳遞，引起細(xì)胞增殖、分化和功能改變，抵御外來病原體[10-11]。蔡晶等[12]通過小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定、免疫器官重量法、T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8測定等方法，評價了太子參多糖對小鼠免疫功能的影響，結(jié)果顯示太子參能增加免疫器官重量，提高正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，能不同程度地使CD3、CD4、CD4/CD8升高，使CD8下降，說明太子參多糖粗提物對小鼠非特異性免疫功能有促進(jìn)作用。吳秀欽等[13]運用MTT法比較了9種硒化多糖對 RAW264.7巨噬細(xì)胞體外增殖的影響，檢測了硒化多糖對細(xì)胞免疫活性的影響，結(jié)果顯示其中4種硒化太子參多糖促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對中性紅的吞噬能力，NO產(chǎn)生量以及IL-6、TNF-α分泌，但文中沒有對未硒化的太子參多糖免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行說明，本文研究了太子參多糖作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7后對巨噬細(xì)胞NO及細(xì)胞因子TNF-a生成的影響，探討了不同濃度太子參多糖對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的影響。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

藥材太子參經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院龍慶德老師鑒定為石竹科植物孩兒參[Pseudostellariaheterophylla(Miq．) Pax ex Pax et Hoffm．]的干燥塊根，符合《中國藥典》(2010年版)太子參62頁項下的有關(guān)規(guī)定。1640培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司)；胎牛血清(購自浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(北京索萊寶)，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)，PBS為實驗室自制(pH為7.4)。

1.2 試藥

太子參多糖的制備：太子參藥材1.2 kg用70%乙醇提取2次(2 h、1.5 h)，藥渣晾干后用水提取2次(2 h、1.5 h)，提取液經(jīng)濃縮至一定體積后用80%乙醇沉淀多糖，經(jīng)Sevage法(氯仿∶正丁醇體積比=5∶1)除去蛋白質(zhì)得較純多糖(縮寫PHPs)，經(jīng)苯酚-硫酸法測定的糖含量為90.2%。脂多糖(LPS，Escherichiacoll055:B5，Sigma)；多粘菌素B(PMB，Sigma)。

1.3 細(xì)胞株

RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株，購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)，酶標(biāo)儀(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，雙人雙面超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 樣品處理

所有樣品用PBS配制成1 g/mL母液，均于-20 ℃凍存?zhèn)溆?，臨用時用培養(yǎng)液稀釋。

2.2 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞，用含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1鏈霉素的1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。所有實驗用細(xì)胞均在細(xì)胞呈指數(shù)生長期，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積70%～80%時傳代鋪板。

2.3 不同濃度太子參多糖對RAW264.7細(xì)胞毒性考察

選取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以每孔100 μL，106個·mL-1種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。實驗分為正常對照組和太子參多糖組。正常對照組每孔加入100 μL 1640培養(yǎng)液；太子參多糖組(PHPs)(0.3、0.4.、0.6、0.8、1 mg·mL-1)作用RAW264.7細(xì)胞24 h后用MTT法檢測細(xì)胞存活率。

2.4 不同濃度太子參多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO藥效考察

選取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以每孔100 μL，106個·mL-1種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。實驗分為正常對照組、太子參多糖組。正常對照組每孔加入100 μL 1640培養(yǎng)液；太子參多糖組(150、300、400、600 μg·mL-1)作用RAW264.7細(xì)胞24 h后用Gress試劑(1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride, and 2.5% phosphoric acid)與上清液1∶1反應(yīng)10 min后于540 nm波長下檢測。

為了進(jìn)一步考察太子參多糖是否真的具有刺激巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生NO的作用。我們將太子參多糖中加入多粘菌素B后，再進(jìn)行NO檢測。選取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以每孔100 μL，106個·mL-1種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。實驗分為正常對照組、PHPs組(600 μg·mL-1)和PHPs+PMB(100 μg·mL-1)組。正常對照組每孔加入100 μL 1640培養(yǎng)液；LPS組加入空白培養(yǎng)液；PHPs和PHPs+PMB組分別加入含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用Gress試劑(1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride, and 2.5% phosphoric acid)與上清液1:1反應(yīng)10 min后于540 nm波長下檢測。

2.5 不同濃度太子參多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α藥效考察

選取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以每孔100 μL，106個·mL-1種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。實驗分為正常對照組、LPS組和太子參多糖組。正常對照組每孔加入100 μL 1640培養(yǎng)液；PHPs(0.15、0.3、0.6 mg·mL-1)作用RAW264.7細(xì)胞24 h后，用ELSA法檢測培養(yǎng)液中TNF-α的含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS(11.5)統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。結(jié)果用Mean±SEM表示。單因素方差分析(One-Way ANOVA)后，用Dunnett′s test分析方法比較組間差異。兩組間比較采用T-test 法。α=0.05為有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度太子參多糖對RAW264.7細(xì)胞毒性考察

圖1 不同濃度的太子參多糖對RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞的毒性

(以空白為陽性對照，不同藥物與空白組相比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

圖1結(jié)果表明：太子參多糖的安全濃度為0.6 mg/mL。

3.2 不同濃度太子參多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO藥效考察

圖2 不同濃度的太子參多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO(兩組之間比較，***P<0.001)

圖2結(jié)果表明：太子參多糖具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO的作用，但是，參照藥脂多糖(LPS)也同樣具有刺激巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生炎癥因子NO的作用[14]，因此，實驗中還加入了抗脂多糖的藥物多粘菌素B后再進(jìn)行檢測，已驗證是否是由于組分中存在內(nèi)毒素而造成巨噬細(xì)胞釋放NO[15]。

圖3 PHP中加入100 μg/mL多粘菌素B進(jìn)行共培養(yǎng)后，測定NO值(與空白組比較###P<0.001，兩組之間比較，***P<0.001)

圖3結(jié)果表明：太子參多糖可顯著增加NO產(chǎn)量，但是加入多粘菌素B后，其NO值沒有降低，說明太子參多糖可激活巨噬細(xì)胞，從而達(dá)到提高機(jī)體免疫功能的目的。

3.3 不同濃度太子參多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α

圖4 不同濃度的太子參多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α(兩組之間比較，***P<0.01)

圖4結(jié)果表明：太子參多糖可顯著增加TNF-α的釋放，說明太子參多糖可激活巨噬細(xì)胞，從而達(dá)到提高機(jī)體免疫功能的目的。

4 討 論

本文探討了不同濃度太子參多糖(PHPs)對RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的影響。分別考察了細(xì)胞存活率、NO釋放率以及TNF-α含量，實驗結(jié)果表明太子參多糖可顯著促進(jìn)NO釋放，并且加入多粘菌素B共培養(yǎng)后，太子參多糖組分并沒有受到多粘菌素B的影響，并且可以顯著產(chǎn)生TNF-α，但其作用強(qiáng)度與LPS比較仍然較弱，因此本文初步說明了太子參多糖能夠激活巨噬細(xì)胞，具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性。但是由于單用RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞僅可以作為體外篩選的實驗，但要闡明其免疫增強(qiáng)作用，還須用到人或動物分離的單核/巨噬細(xì)胞實驗，還宜在動物模型上加以證明。因此在后續(xù)的研究工作中，作者將進(jìn)行深入研究。