史興清

(江西省景德鎮(zhèn)市第三人民醫(yī)院藥劑科，景德鎮(zhèn) 333000)

貞丹護(hù)肝方系本院中醫(yī)科治療肝炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由女貞子、丹參、五味子、大黃、蒲公英、茵陳、黃芪、茯苓、甘草等藥物組成，具有解毒化瘀，滋陰養(yǎng)肝，益氣健脾的功效。該方臨床用于急慢性肝炎具有較好的療效。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝炎的作用，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄兼用。購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部。

1.2 受試藥物 貞丹護(hù)肝方由女貞子6g、丹參6g、五味子 3g、大黃 3g、蒲公英 6g、茵陳 6g、黃芪 6g、茯苓6g、甘草3g組成。以湯劑形式應(yīng)用，方藥調(diào)配后煎湯取汁，濃縮成1g/ml（按生藥計）濃度的藥液，冰箱保存?zhèn)溆?。臨用時以生理鹽水稀釋后灌胃給藥。給藥劑量以方藥總量45g/60kg為人用劑量，以該劑量乘以換算系數(shù)9后取整數(shù)6.0g/kg為小鼠中劑量組用量。取小鼠中劑量乘以1.5倍為高劑量組用量，乘以0.5倍為低劑量組用量。對照藥：聯(lián)苯雙酯滴丸，浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑 四氯化碳：天津市化學(xué)試劑一廠；D-氨基半乳糖：Sigma公司；卡介苗(BCG)，蘭州生物制品研究所；脂多糖(LPS)，Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 貞丹護(hù)肝方對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響 昆明種小鼠60只，體重（20±2）g，雌雄各半。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成空白對照組、模型組、貞丹護(hù)肝方高、中、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組，共6組。除空白對照組動物外，其余各組小鼠灌胃0.2%(v/v)四氯化碳橄欖油溶液，灌胃劑量為0.1ml/10g鼠體重。于造模后24h、48h、71h，貞丹護(hù)肝方高、中、低劑量組分別給予貞丹護(hù)肝方煎劑9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，共3次。第72h后，全部動物眼眶取血，4000r/min離心10min，分離血清，測定ALT。

2.2 貞丹護(hù)肝方對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用 取昆明種小鼠60只，體重（20±2）g，雌雄各半。分組同2.1。貞丹護(hù)肝方高、中、低劑量組分別給予貞丹護(hù)肝方煎劑9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。每天1次，共7d。末次給藥后1h，除空白對照組外，其他各組小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖8mg/10g體重，24h后眼球取血，常規(guī)分離血清，測定ALT含量。

2．3貞丹護(hù)肝方對小鼠免疫性肝損傷的影響 取昆明種小鼠 60只，體重（20±2）g，雌雄各半。 分組同2．1。除空白對照組外其他各組小鼠尾靜脈給小鼠尾靜脈注射(iv)卡介苗（BCG）漿液 0.2ml/只(含5×106個菌)，致敏后10d，再尾靜脈注射脂多糖（LPS）(7.5μg/只)，造成免疫性肝炎模型。 從小鼠尾靜脈注射BCG的當(dāng)天開始，貞丹護(hù)肝方高、中、低劑量組分別給予貞丹護(hù)肝方煎劑9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白對照組和模型組小鼠灌胃等容量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7d。在尾靜脈注射LPS 10h后眼球取血，常規(guī)分離血清，測定ALT含量。取血后處死小鼠，取肝左葉固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，普通光鏡觀察組織病理學(xué)情況。

2.4 統(tǒng)計方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差分析，q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 貞丹護(hù)肝方對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表1。表1顯示，與模型組比較，貞丹護(hù)肝方各劑量組對CCl4造成的急性肝損傷小鼠ALT升高有顯著的降低作用(P<0.01)。

3.2 貞丹護(hù)肝方對D一氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表2。表2顯示，與模型組比較，貞丹護(hù)肝方各劑量組對D-氨基半乳糖造成的肝損傷小鼠ALT活性升高有顯著的降低作用(P<0.01)。

3.3 貞丹護(hù)肝方對小鼠免疫性肝損傷的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3。表3顯示，與模型組比較，貞丹護(hù)肝方各劑量組對免疫性肝損傷小鼠ALT活性升高有顯著的降低作用(P<0.01)。其中貞丹護(hù)肝方中劑量組與聯(lián)苯雙酯組比較也有顯著性差異(P<0.05)。

表2 貞丹護(hù)肝方對D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠血清ALT含量的影響(x±s，n=10)

表3 貞丹護(hù)肝方對免疫性肝損傷小鼠血清ALT含量的影響(x±s，n=10)

3．4貞丹護(hù)肝方對免疫性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 光鏡下觀察可見模型組小鼠肝細(xì)胞呈脂肪變性，伴有點(diǎn)狀壞死，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，有明顯炎細(xì)胞浸潤；貞丹護(hù)肝方高、低劑量組和聯(lián)苯雙酯組可見炎細(xì)胞浸潤，但病理程度較模型組明顯減輕；貞丹護(hù)肝方中劑量組僅見少數(shù)炎細(xì)胞浸潤，其病理程度最輕。

4 討論

貞丹護(hù)肝方由女貞子、丹參、五味子、大黃、蒲公英、茵陳、黃芪、茯苓、甘草等藥物組成。方中女貞子滋養(yǎng)肝陰，富含保肝降酶的齊墩果酸；丹參活血化瘀改善肝臟血流，且有抗肝纖維化作用；五味子為保肝降酶要藥；大黃、蒲公英、茵陳清熱利濕解毒；黃芪、茯苓益氣健脾，扶助正氣以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，諸藥合用用，臨床用于治療肝炎具有良好效果。

本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳肝損傷、D-氨基半乳糖肝損傷和免疫性肝損傷3種肝炎模型進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示貞丹護(hù)肝方對上述3種實(shí)驗(yàn)性肝炎均有明顯效果。

四氯化碳引起肝損傷模型是肝損傷的經(jīng)典模型。其特點(diǎn)是能準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，重復(fù)性好[1，2]。D-氨基半乳糖是肝細(xì)胞的磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，可造成肝臟彌漫性變性、壞死和炎癥反應(yīng)，與臨床上急性普通型肝炎的病理變化接近[3，4]，免疫性肝損傷動物模型接近人類病毒性肝炎肝炎發(fā)生的病理生理過程，病毒性肝炎引起的肝損傷主要由機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)所介導(dǎo)，當(dāng)病毒激活機(jī)體免疫系統(tǒng)后，產(chǎn)生病毒特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。它們不但能與體內(nèi)病毒起反應(yīng)而加以殺滅，也會損傷表面帶有病毒抗原的肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性腫脹和壞死[5，6]。

ALT是存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的可溶性酶，當(dāng)肝細(xì)胞因各種因素而出現(xiàn)損傷時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，通透性改變，即可從細(xì)胞內(nèi)逸出細(xì)胞外而進(jìn)人血循環(huán)中。此時血清ALT較正常增高，故血清ALT測定是反映肝損傷的靈敏指標(biāo)[7]。血清ALT水平高低可以反映肝細(xì)胞損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示貞丹護(hù)肝方對上述三種實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型小鼠的ALT升高均有明顯的降低作用，表明貞丹護(hù)肝方具有明顯的抗肝傷作用。本方劑組方用藥量偏輕，因其組方思路遵循藥皆有“毒”，護(hù)肝之劑用量宜輕不宜重的理念。本實(shí)驗(yàn)觀察到中劑量的貞丹護(hù)肝方對于與人類病毒性肝炎肝炎病理變化接近的免疫性肝損傷模型小鼠的ALT升高的降低作用和病理減輕程度有優(yōu)于對照藥物的表現(xiàn)，表明其組方思路有其合理性。本實(shí)驗(yàn)顯示貞丹護(hù)肝方這一中藥方劑在治療肝炎上有其自身優(yōu)勢，值得進(jìn)一步深入研究。