任爍淇 劉冰洋 李雪瑩 邢建輝 李政綸 王 楚 冮慧欣 劉桂豐 姜 靜

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是我國(guó)重要工業(yè)用材樹(shù)種和山地造林樹(shù)種，自20世紀(jì)90年代白樺被列為科技攻關(guān)樹(shù)種以來(lái)，作者所在研究團(tuán)隊(duì)先后開(kāi)展了雜交育種、強(qiáng)化育種、倍性育種等研究[1～5]，尤其在基因工程育種方面取得了一定的成效，自2003年以來(lái)相繼進(jìn)行了白樺耐鹽、縮短童期、改變木質(zhì)素含量等轉(zhuǎn)基因研究[6～9]，迄今為止，獲得了130余個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系，其中在獲得的18個(gè)BpCCR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺中，發(fā)現(xiàn)了一株轉(zhuǎn)基因白樺葉片顏色明顯不同其他轉(zhuǎn)BpCCR1白樺，該轉(zhuǎn)基因株系除了葉色黃化性狀與其他轉(zhuǎn)基因株系有差異外(包括非轉(zhuǎn)基因野生型白樺)，其它表型性狀均無(wú)差異，我們認(rèn)為該株系是由于T-DNA插入(含外源基因)而產(chǎn)生的突變體[9]。

葉色突變是植物中最常見(jiàn)的突變性狀，迄今為止已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)、棉花(AnemonevitifoliaBuch)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等多種植物中發(fā)現(xiàn)了不同類(lèi)型的葉色突變體[10～16]。葉色變異不僅可以作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于水稻等作物的雜交制種，在基礎(chǔ)研究中，葉色突變體是研究植物光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成分解途徑、遺傳表達(dá)機(jī)理、質(zhì)—核基因互作以及信號(hào)傳導(dǎo)途徑等一系列生理代謝過(guò)程的理想材料[17～21]，因此，葉色突變體備受育種工作者的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)以黃葉突變株為試驗(yàn)材料，測(cè)定葉綠素與葉色的時(shí)序變化規(guī)律，分析其生長(zhǎng)特性，研究結(jié)果為后續(xù)開(kāi)展突變基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3年生的轉(zhuǎn)BpCCR1基因白樺黃葉突變體(yl)、轉(zhuǎn)基因株系(CR11)及非轉(zhuǎn)基因野生型白樺(WT)，每個(gè)株系30株，種植于30 cm×20 cm花盆中，置于白樺育種基地進(jìn)行常規(guī)管理。

1.2 方法

1.2.1 葉片顏色的時(shí)序變化

(1)RHS比色：將葉片近軸面與RHS標(biāo)準(zhǔn)比色卡(英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì))進(jìn)行對(duì)比，記錄葉片的顏色。

(2)色差儀比色：采用分光色差儀(KONICA MINOLTA CR-400)測(cè)定參試株系葉片的中部，每個(gè)株系測(cè)定30個(gè)不同單株，每株1個(gè)葉片，取其平均值。測(cè)定于5月1日開(kāi)始，9月11日結(jié)束，每10 d測(cè)定1次。測(cè)量結(jié)果用CIELab表色系統(tǒng)進(jìn)行色度分析，其中，L*代表黑色到白的間的位置，既明亮度(Lumination)，范圍是0～100；a*代表紅(+a)綠(-a)色軸飽和度；b*代表黃(+b)藍(lán)(-b)色軸飽和度(圖1)。

圖1 CIELab表色系統(tǒng)色品圖Fig.1 Chromaticity diagram of CIELab color numeration system

1.2.2 葉片葉綠素含量的測(cè)定

采用便攜式葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502 PLUS，KONICA MINOLTA)測(cè)定yl、CR11及WT株系功能葉的葉綠素相對(duì)含量，讀取SPAD值，測(cè)定于5月1日開(kāi)始，9月11日結(jié)束，每10 d測(cè)定1次，每次每個(gè)株系測(cè)定10株樹(shù)葉片，3次重復(fù)，共計(jì)測(cè)定30個(gè)株系，每株樹(shù)均測(cè)定健康的第4葉片。

1.2.3 生長(zhǎng)性狀調(diào)查

于5月3日開(kāi)始，10月1日結(jié)束，每10 d調(diào)查1次，共調(diào)查14次(以1月1日為第1天，5月3日為第123天，以此類(lèi)推，最后調(diào)查的時(shí)間10月1日為第273天)。用米尺測(cè)量參試株系苗高，待苗木停止生長(zhǎng)后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量地徑，yl、CR11及WT株系分別調(diào)查30株。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用MATLAB Compiler Runtime 8.3對(duì)苗高的生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行Logistic方程擬合，Logistic曲線(xiàn)方程：

(1)

式中：y為苗木苗高(cm)；t為苗木生長(zhǎng)的時(shí)間，1月1日為1 d；a為苗木開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)的苗高初始值(cm)；b為苗木停止生長(zhǎng)時(shí)苗高值(cm)；t0為苗木苗高日生長(zhǎng)速度最快的日期(d)；c為曲線(xiàn)在苗木苗高日生長(zhǎng)速度最快處的斜率(cm·d-1)。

苗木苗高年生長(zhǎng)階段的劃分可通過(guò)對(duì)式(1)求三階導(dǎo)數(shù)，結(jié)果為：

(2)

用t1和t2表示速生期的開(kāi)始期和速生期結(jié)束期，利用t1和t2將苗高的年生長(zhǎng)過(guò)程分為三個(gè)階段：(0，t1)、(t1，t2)、(t2，封頂)。第一階段為“前慢期”，處于該階段的苗木生長(zhǎng)逐漸加快；第二階段為“速生期”，處于該階段的苗木持續(xù)快速生長(zhǎng)；第三階段為“后慢期”，處于該階段的苗木生長(zhǎng)逐漸減慢，直至封頂。在符合“S”型曲線(xiàn)的林木個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程中，速生期是林木生長(zhǎng)的關(guān)鍵階段[22～23]，通過(guò)擬合方程得出幾個(gè)速生期參數(shù)。

(1)速生期的起始點(diǎn)t1；

(2)速生期的結(jié)束點(diǎn)t2；

(3)速生點(diǎn)t0；

(4)速生期的持續(xù)時(shí)間RR=t2-t1；

(5)速生期苗高的平均生長(zhǎng)量GR=t2點(diǎn)的苗高-t1點(diǎn)的苗高；

(6)速生期內(nèi)苗高日生長(zhǎng)量的平均值GD=GR·RR-1；

(7)速生期內(nèi)生長(zhǎng)量占總生長(zhǎng)量的比值RRA=GR·(b-a)-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃葉突變株葉色時(shí)序變化規(guī)律

RHS比色卡測(cè)定結(jié)果顯示，yl突變株的葉色一直呈現(xiàn)深黃綠色，CR11(轉(zhuǎn)基因?qū)φ?株系的葉色在6月初為深黃綠色，隨后漸漸的變?yōu)闇\橄欖綠或暗橄欖綠，而WT(野生型)株系從6月上旬開(kāi)始葉色由原來(lái)的淺橄欖綠漸漸的變?yōu)榘甸蠙炀G。總之，參試株系的生長(zhǎng)發(fā)育階段，yl的葉色主要呈現(xiàn)深黃綠色，而兩個(gè)對(duì)照株系的葉色是以橄欖綠色為主(圖2)。

色度計(jì)測(cè)定結(jié)果顯示，在生長(zhǎng)季的不同發(fā)育時(shí)期，參試株系葉片的a*值均小于0，而b*值均大于0，葉片顏色均分布于表色系統(tǒng)色品圖的第二象限黃綠色區(qū)域(圖1),黃葉突變株的L*值為48.17～56.77；a*值為-20.04～-15.02；b*值為23.1～44.3，而對(duì)照株系的L*值為29.65～43.89；a*值為-15.97～-6.64，b*值為7.06～23.68(圖3)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃葉突變株的L*值和b*值均顯著高于2個(gè)對(duì)照株系，a*值顯著低于2個(gè)對(duì)照株系(P≤0.05)。表明黃葉突變株的葉色在不同發(fā)育時(shí)期其亮度及黃色程度均高于2個(gè)對(duì)照株系，從黃葉突變株葉色參數(shù)b*值也可以看出其葉色更趨向于CIELab系統(tǒng)色拼圖的黃色區(qū)域。

圖2 不同發(fā)育期參試株系葉片顏色觀(guān)察 a～c.6月5日的葉色；d～f.7月5日的葉色；g～i.8月5日的葉色；j～l.9月5日的葉色 a.WT(146 Moderate Olive Green A)；b.CR11轉(zhuǎn)基因株系(144 Strong Yellow Green A)；c.黃葉突變株(N144 Strong Yellow Green A)；d.WT(NN137 Greyish Olive Green D)；e.CR11(137 Moderate Olive Green B)；f.黃葉突變株(144 Strong Yellow Green A)；g.WT(NN137 Greyish Olive Green A)；h.CR11(139 Dark Yellowish Green A)；i.黃葉突變株(144 Strong Yellow Green A)；j.WT(NN137 Greyish Olive Green A)；k.CR11(139 Dark Yellowish Green A)；l.黃葉突變株(144 Strong Yellow Green A)Fig.2 Leaf color observation in different development periods of the test lines a-c. The leaf color on June 5；d-f. The leaf color on July 5；g-i. The leaf color on August 5；j-l. The leaf color on September 5

2.2 黃葉突變株葉綠素含量的時(shí)序變化

由圖4可見(jiàn)，從早春到9月中旬，2個(gè)對(duì)照株系各發(fā)育時(shí)期其葉綠素SPAD值均顯著高于黃葉突變株(P<0.05)，2個(gè)對(duì)照株系SPAD均值為39.15，而yl突變株系的SPAD值為18.84，僅是2個(gè)對(duì)照株系的48.12%。

圖3 參試株系葉片L*值、b*值、a*值時(shí)序變化 a、b、c為同一時(shí)間點(diǎn)3個(gè)參試株系L*值、b*值、a*值的多重比較Fig.3 Temporary variation of test lines about value a,value b and value L a,b and c in figures indicate the multiple comparisons between test lines about value a,value b and value L in the same time

圖4 參試株系葉綠素含量相對(duì)含量時(shí)序變化 a、b、c為同一時(shí)間點(diǎn)3個(gè)參試株系SPAD值的多重比較Fig.4 Temporary variation of the test lines about relative chlorophyll content a,b and c in figures indicate the multiple comparisons between test lines about SPAD value in the same time

2.3 黃葉突變株生長(zhǎng)特性分析

2.3.1 參試株系苗高生長(zhǎng)模型的建立與擬合

分別對(duì)參試株系苗高生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行擬合(圖5)，3個(gè)株系苗高生長(zhǎng)過(guò)程為“S”型曲線(xiàn)，用4參數(shù)Logistic方程式(1)對(duì)3個(gè)株系共90個(gè)單株苗高進(jìn)行擬合取平均值，方程中各參數(shù)見(jiàn)表1，各生長(zhǎng)模型方程的擬合系數(shù)均高于0.95，達(dá)到顯著水平，說(shuō)明用4參數(shù)Logistic曲線(xiàn)方程對(duì)參試株系生長(zhǎng)節(jié)律進(jìn)行擬合是準(zhǔn)確可靠的，可用于參試株系高生長(zhǎng)分析與預(yù)測(cè)。

由表1可知，yl突變株與2個(gè)對(duì)照株系的苗高生長(zhǎng)(即停止生長(zhǎng)后的實(shí)測(cè)值)差異顯著(P<0.05)，yl苗高顯著低于2個(gè)對(duì)照株系，yl苗高均值僅為2個(gè)對(duì)照株系均值的35.15%，其苗高速生點(diǎn)處的生長(zhǎng)速度為0.755 cm·d-1，顯著低于2個(gè)對(duì)照株系，僅為2個(gè)對(duì)照均值的50.9%。

2.3.2 黃葉突變株速生期生長(zhǎng)參數(shù)變異

參試株系苗高從5月初開(kāi)始生長(zhǎng)，9月中下旬封頂，生長(zhǎng)期約為140 d。由表2可知，yl突變株與2個(gè)對(duì)照株系從開(kāi)始生長(zhǎng)、到進(jìn)入速生期以及速生期結(jié)束的時(shí)間基本一致，不同的是yl在速生期內(nèi)苗高的平均生長(zhǎng)量(GR)為38.61 cm，顯著低于2個(gè)對(duì)照株系，其速生期內(nèi)苗高日生長(zhǎng)量均值(GD)也顯著低于2個(gè)對(duì)照株系，僅為2個(gè)株系均值的58.50%，yl與2個(gè)對(duì)照株系的速生期內(nèi)生長(zhǎng)量占總生長(zhǎng)量的比值RRA無(wú)明顯差異。

3 討論

植物隨季節(jié)的變化往往葉片顏色也伴隨著的變化，特別是春秋兩個(gè)季節(jié)葉色的變化更明顯。野生型白樺葉片春季開(kāi)始萌葉，即葉片在生長(zhǎng)初期，其葉綠素含量較少，其葉綠素SPAD值僅為32.41，到了8月以后，SPAD值達(dá)到48.61，即由淺橄欖綠逐漸變?yōu)榘甸蠙炀G，只有在落葉前葉片呈現(xiàn)黃色。而黃葉突變株葉片顏色明顯不同野生型白樺，在其生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)葉綠素SPAD值一直顯著低野生型白樺，從早春到深秋葉片始終為深黃綠色。植物葉色變異也往往與葉綠體中色素含量的變化有關(guān)[22～24]。在多數(shù)黃化突變體中,其葉綠素的含量顯著低于野生型[25～26]，白樺黃葉突變株與前人研究結(jié)果類(lèi)似，即葉色在各發(fā)育時(shí)期其葉綠素SPAD值均顯著低于對(duì)照株系(P<0.05)，yl突變株系的SPAD值為18.84，僅為2個(gè)對(duì)照株系的48.12%。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量多少不僅影響葉片顏色，同時(shí)也影響植物生長(zhǎng)與產(chǎn)量等[27]。對(duì)水稻低葉綠素含量突變體研究發(fā)現(xiàn)，該突變體雖然葉綠素含量降低，但葉綠體的發(fā)育并未受到影響，高光強(qiáng)下其并未受到光抑制，光反應(yīng)電子傳遞也未受影響。產(chǎn)量數(shù)據(jù)表明，黃葉突變體的產(chǎn)量與對(duì)照無(wú)顯著差別[27]。而本實(shí)驗(yàn)的黃葉樺突變株則與前人研究結(jié)果不同，葉綠素SPAD值較對(duì)照株系顯著降低，其苗高生長(zhǎng)也顯著低于2個(gè)對(duì)照株系，即速生期內(nèi)苗高均值僅是2個(gè)對(duì)照株系均值的69%。推測(cè)yl突變體苗高生長(zhǎng)低于對(duì)照株系可能是葉綠體發(fā)育異常，以及葉綠素含量的降低所致。人們?cè)趯?duì)白榆(Ulmuspumila)的天然黃葉突變體中華金葉榆的研究中也發(fā)現(xiàn)，其苗高生長(zhǎng)緩慢，葉綠素含量及凈光合速率顯著低于綠葉白榆[28]。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，諸多研究表明由葉綠素合成缺陷而產(chǎn)生的突變體，其葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)也將發(fā)生一定的變化[29]，葉綠素的合成是一個(gè)由許多酶參與的復(fù)雜過(guò)程，從谷氨酰-tRNA(Glu-tRNA)開(kāi)始到葉綠素b的合成結(jié)束為止一共包括16步，涉及20多個(gè)基因編碼的16種酶參與完成，該途徑中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生突變都可能影響葉綠素的合成，從而引起葉色變異[30]。因此，葉色突變的分子機(jī)制較為復(fù)雜，引起葉色突變的基因種類(lèi)也繁多，yl突變體是研究團(tuán)隊(duì)獲得的白樺T-DNA插入突變體，目前突變基因的克隆正在進(jìn)行中，一旦獲得引起突變性狀的基因并驗(yàn)證其功能，將可解釋yl突變體類(lèi)囊體發(fā)育異常和葉綠素合成缺陷等現(xiàn)象，也將為園林綠化彩葉樹(shù)基因工程育種提供基因資源。

圖5 參試株系樹(shù)高邏輯斯蒂擬合曲線(xiàn)Fig.5 Logistic fitting curve of the test lines about height

株系Lines封頂后苗高實(shí)測(cè)值Measure values of height when test lines stop growing(cm)R2苗木開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)苗高值aValues of height when test lines start growing(cm)苗木停止生長(zhǎng)時(shí)苗高值bValues of height when test lines stop growing(cm)速生點(diǎn)t0Fast-growing point(d)苗高速生點(diǎn)處生長(zhǎng)速度The growing speed on fast-growing point(cm·d-1)WT(對(duì)照1)Control group 1244.7(a)0.9898155.4375(a)244.7(a)190(a)1.484(a)CR11(對(duì)照2)Control group 2207.1(b)0.9884120.6(b)207.1(b)200(b)1.481(a)yl146.5(c)0.959997.2(c)146.5(c)194(ab)0.755(b)

表2 參試株系速生期生長(zhǎng)參數(shù)比較