朱 弘 伊賢貴 朱淑霞 王華辰 段一凡 王賢榮

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，熱帶森林生物多樣性保護(hù)國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗室，南京 210037)

我國是現(xiàn)代櫻屬的分布中心之一，廣泛分布于中國廣闊的溫帶及亞熱帶區(qū)域，共計48種及10變種，其中33個種為特有分布[1]。俞德浚和李朝鑾[2]依據(jù)腋芽單生和三芽并生進(jìn)一步將該屬劃分為典型櫻亞屬(Subg.CerasusKoehne)和矮生櫻亞屬(矮李類)﹝Subg.Microcerasus(Koehne) Yu et Li﹞；其中典型櫻亞屬即為世人所熟知的櫻花類植物，具有重要的生態(tài)價值、觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值和文化價值。同時也被認(rèn)為是櫻屬中較為進(jìn)化的一個亞屬，其下又細(xì)分9個組，對于研究薔薇科系統(tǒng)演化具有重要的意義[3～4]。由于典型櫻亞屬植物分布廣泛、生境多樣，復(fù)雜地理氣候影響以及因種間、種內(nèi)存在頻繁的天然雜交導(dǎo)致的網(wǎng)狀進(jìn)化，導(dǎo)致分化持續(xù)進(jìn)行，在形態(tài)上表現(xiàn)出高度的連續(xù)變異性，加之該亞屬植物花葉不同期的物候?qū)W特性，使得傳統(tǒng)手段對其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別難度較大，從而限制了野生資源的認(rèn)識與開發(fā)利用。為了對其進(jìn)行更科學(xué)準(zhǔn)確的分類，前人先后采用等位酶[5]、RFLP[6]、RAPD[7]、SSR[8]等不同類型的分子標(biāo)記技術(shù)，開展了該亞屬親緣關(guān)系與分類學(xué)的研究，積累了一定的分子資料，然而部分分子證據(jù)與前人基于形態(tài)學(xué)等經(jīng)典手段的觀點(diǎn)存在出入。近年來，分子系統(tǒng)學(xué)特別是DNA測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展有力的推動了該亞屬植物的研究進(jìn)程，例如Lee和Wen[9]基于ITS與Bortiri等[3,10～11]先后基于核基因ITS、s6pdh與葉綠體trnL-trnF、trnS-trnG多個片段的廣義李屬(PrunusL.)系統(tǒng)發(fā)育多個重建結(jié)果均表明，櫻屬是一個多系起源類群，其中典型櫻亞屬與稠李亞屬(Subg.PadusMill)、桂櫻亞屬(Subg.LaurocerasusTourn. ex Duh.)在廣義李屬下構(gòu)成單系分支。

葉綠體DNA具有高度的序列保守性、不受選擇壓力和獨(dú)立的進(jìn)化路線等特點(diǎn)，而非編碼區(qū)相比編碼區(qū)序列具有更高的堿基替換率，適合種屬內(nèi)及低階元的親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究，近年來備受系統(tǒng)分類學(xué)家青睞[12]；其中atpB-rbcL序列位于編碼ATP合成酶β基亞(atpB)基因和核酮糖1，5二磷酸羧化酶大亞基rbcL基因之間的非編碼區(qū)域，擁有相對較多的有效信息位點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于維管束植物系統(tǒng)發(fā)育的研究中[13～14]，尤其是在較低分類群的進(jìn)化分析和鑒定，例如王華坤等[15]利用該區(qū)間研究了薔薇科核果類果樹的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；此外，近年來有學(xué)者[16～17]基于該片段還發(fā)表了櫻屬新種。

典型櫻亞屬依然存在不少物種界定的問題，尾葉櫻桃(C.dielsiana)種系就是其中一個突出的例子，原變種尾葉櫻桃與種下短梗尾葉櫻桃(C.dielsianavar.abbreviate)、長柱尾葉櫻(C.dielsianavar.longistyla)，種間又與浙閩櫻桃(C.schneideriana)等近緣種較難區(qū)分，而近年來陳子林等發(fā)表的櫻屬新種—磐安櫻桃(C.pananensis)無疑又增加了該類群的爭議和混淆，因此對該亞屬種間親緣關(guān)系及分類地位開展深入研究具有重要的理論和實(shí)際意義。鑒于上述情況，筆者采用廣義李屬的概念，著重典型櫻亞屬內(nèi)取樣，采用atpB-rbcL片段為代表的DNA條碼的分子標(biāo)記手段，主要目標(biāo)在于：(1)驗證該序列在典型櫻亞屬的低分類階元鑒定中的可行性，從而為櫻屬及其近緣屬植物DNA條碼篩選提供參考；(2)結(jié)合前人發(fā)表序列，擴(kuò)大典型亞屬內(nèi)的物種取樣，從母系遺傳背景上對典型櫻亞屬及其近緣物種進(jìn)行種間關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育重建；(3)探討尾葉櫻桃(P.dielsiana)與長柱尾葉櫻桃(P.dielsianavar.longistyla)及其與新發(fā)表的磐安櫻桃(P.pananensis)等近緣種的分類地位，以期為典型櫻亞屬植物的分類地位與系統(tǒng)發(fā)生研究積累分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

研究共涉及典型櫻亞屬7種(含1變種)。其中高盆櫻桃(P.cerasoides)、尾葉櫻桃、長柱尾葉櫻桃為本研究新獲得的15條序列，其新鮮幼嫩葉片為課題組于2017～2018年采自3個省4個縣(市)的野生居群，由于尾葉櫻桃分布零星，故選取3個縣域的種源作為代表，而高盆櫻桃和長柱尾葉櫻桃分別為單個縣域下單個代表居群，其居群內(nèi)不同個體取樣間距保持在30 m以上，采集地點(diǎn)信息及憑證標(biāo)本號見(表1)；迎春櫻桃(P.discoidea)、磐安櫻桃、浙閩櫻桃(P.schneideriana)和山櫻花(P.serrulata)材料信息及對應(yīng)的15條序列(JX84285～JX84291，JX84379～JX84383，JX847392～JX847394，JX847384)均引自Chen等[17]報道；此外，加入火棘(Pyracanthafortuneana)和水榆花楸(Sorbusalnifolia)各1條作為外類群，亦下載自GenBank的公共數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)。

表1 測序材料來源

1.2 基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

取硅膠干燥的新鮮葉片0.65 g，用研缽與液氮研磨粉碎，采用天根(TIANGE)植物基因組試劑盒提取總DNA。通過質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳和Tanon-2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，將樣品DNA保存至4℃冰箱，用于后續(xù)PCR實(shí)驗。atpB-rbcL序列依據(jù)葉立新等[16]所述，正反引物分別為：5′-ACATCKARTACKGGACCAATAA-3′，5′-AACACCAGCTTTRAATCCAA-3′。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中含DNA模板2.0 μ·mol-1，上下游引物各1.0 μL，2×Taq Master Mix(天根)12.5 μL，8.5 μL ddH2O補(bǔ)齊。DNA擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，52.2℃退火1 min，72℃延伸3 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的樣品送至南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行純化及測序，在ABI3730測序儀完進(jìn)行單向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

多序列比對(聯(lián)配)、手工校正在Bioeditor 7.0.9軟件[18]中及Clustal W模塊完成；使用DNASP5軟件[19]進(jìn)行堿基組成、插入/缺失(indels)的序列特征分析，并統(tǒng)計確定單倍型(Haplotype)數(shù)量(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)；再使用Network 5.003軟件[20]基于最大簡約性原則的中介鄰接網(wǎng)絡(luò)法(Median-Joining network，MJ)繪制不同單倍型間的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖，插入/缺失處理為一次突變事件，在Adobe Illustrator CS6軟件進(jìn)行手工調(diào)整與布局優(yōu)化；最后利用MEGA5軟件[21]以鄰接法(Neighbor Joining，NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood，ML)與最大簡約(Maximum parsimony，MP)3種算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用自展法(Bootstrap)1 000次重復(fù)對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢測，標(biāo)記在分支上。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果、序列特征

典型櫻亞屬3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳抽樣檢測后(3個為1組)，在500～1 000 bp出現(xiàn)一清晰目的條帶(圖1)。測序后，將實(shí)驗新增的15條序列與下載的15條序列進(jìn)行比對、兩端截齊，獲得用于序列分析的30條序列矩陣全長為780 bp，在774個有效位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)15個變異(多態(tài)性)位點(diǎn)(表2)，占分析序列的1.94%，其中簡約信息位點(diǎn)14個，單一突變位點(diǎn)(SNP)1個，6個插入/缺失(位于1、339、341、680、767和777處)；(G+C)含量為29.50%，(A+T)含量為70.50%，存在明顯的A-T偏好。將序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性檢索，均有較好的匹配程度，確認(rèn)所測序列為目標(biāo)序列。

圖1 引物atpB-rbcL的部分PCR擴(kuò)增結(jié)果 1.高盆櫻桃；2.尾葉櫻桃；3.長柱尾葉櫻桃Fig.1 Results of PCR amplification of partial atpB-rbcL primers 1.P.cerasoides; 2.P.dielsiana; P.dielsiana var. longisty

2.2 單倍型分布與中介鄰接網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在7個物種的30條序列中共檢測到9個單倍型(表2，圖2)，物種間平均單倍型多樣性(Hd=0.880 5±0.026)，平均核苷酸多態(tài)性(π=0.007 11±0.000 54)；單倍型類型與物種存在良好的對應(yīng)關(guān)系，其中尾葉櫻桃擁有3個單倍型(Hap5～Hap7)，單倍型多樣性最高，并與長柱尾葉櫻桃(Hap8)以2個突變步數(shù)相連，在典型櫻亞屬中構(gòu)成一個獨(dú)立的分枝(藍(lán)色虛線方框)；磐安櫻桃(Hap4)位于中介網(wǎng)絡(luò)圖的軀干上，依次與mv1、mv2和mv3以1～2個突變步數(shù)相連，顯示其較為原始的進(jìn)化地位；迎春櫻桃(Hap1)與之相距最遠(yuǎn)(相差4個突變步數(shù))，獨(dú)立進(jìn)化成枝；其次為高盆櫻桃(Hap3)和山櫻花(Hap9)，分別相差3個突變步數(shù)和2個突變步數(shù)；浙閩櫻桃(Hap2)與之距離最近(僅相差1個突變步數(shù)，在264 bp處存在堿基突變)，顯示出較近的親緣關(guān)系。

表2 atpB-rbcL片段9個單倍型的變異位點(diǎn)統(tǒng)計

注： *表示堿基與單倍型Hap1相同。

Note: * the same as the Haplotype 1.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的比較和分析

為進(jìn)一步闡明單倍型(Hap1～Hap9)的系統(tǒng)關(guān)系，本研究以水榆花楸和火棘為外類群分別構(gòu)建NJ、MP和ML系統(tǒng)樹(圖3)。三個算法的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致：外類群(CladeⅠ)與典型櫻亞屬(CladeⅡ)形成兩大分支。在典型櫻亞屬分枝中，又可分為4個獨(dú)立組，其中迎春櫻桃(Group D)與浙閩櫻桃(Group C)各自構(gòu)成2個組；高盆櫻桃、山櫻花、長柱尾葉櫻桃和尾葉櫻桃構(gòu)成1個組(Group B)；磐安櫻桃比較特殊，位于系統(tǒng)發(fā)育樹基部，以梳齒狀結(jié)構(gòu)與其他種成為并系，沒有得到很好的分化。

3 討論

3.1 atpB-rbcL片段在典型櫻亞屬間分類中的應(yīng)用評價

Network網(wǎng)絡(luò)分析法能清晰地表明各單倍型間的關(guān)系(分布頻率、基因流方向)，可以從DNA序列水平反應(yīng)物種間的遺傳多樣性[22]。在中介鄰接網(wǎng)絡(luò)圖中，除尾葉櫻桃單倍型外(Hap5～Hap7)，不同種類物種均對應(yīng)1個獨(dú)特的單倍類型，具有較豐富的遺傳多樣性，這可能與本次實(shí)驗的尾葉櫻桃材料來源地多樣(表1)有關(guān)，同時也表明atpB-rbcL序列在典型櫻亞屬種內(nèi)保守，在種間不保守；在系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建中，相比筆者先前自測的ndhF或rbcL序列(未發(fā)表)僅能滿足亞屬間劃分的分辨率需求，該片段序列提供的變異位點(diǎn)較多(6個位點(diǎn)發(fā)生了插入或缺失)，主要分支的支持度較高，因此可作為薔薇科典型櫻亞屬系統(tǒng)發(fā)育重建提供較豐富的信息。王化坤等[4]就利用atpB-rbcL片段研究了櫻桃(P.pseudocerasus)部分品種與其它核果類的演化順序，平均變異率達(dá)到22/736=0.029 9，但分子進(jìn)化速率在各物種間的分布不均勻。由于本研究僅使用了單個葉綠體片段對典型櫻亞屬下7個種進(jìn)行了初步分析，雖然在部分種間具有顯著的分子特征，存在無法完全將所有種分開的局限性，今后一方面可考慮增加核單拷貝基因及多片段組合進(jìn)行聯(lián)合建樹分析，另一方面，對于消失的祖先單倍型(圖2)，推測原因也可能與樣本不足有關(guān)，應(yīng)該加入更多典型櫻亞屬內(nèi)所涉及物種材料及物種的群體分布地取樣，以便得到更加準(zhǔn)確有效的分析結(jié)果。

3.2 磐安櫻桃分類地位的探討

磐安櫻桃[17]作為2013新發(fā)表的櫻屬新種，一直備受爭議，有待更多的證據(jù)予以驗證。外部形態(tài)特征上與浙閩櫻桃、尾葉櫻桃存在交叉和過渡，造成在實(shí)踐中較難區(qū)分，例如，三者的共征在于全株毛被顯著，在嫩枝、葉柄、葉脈(主脈和側(cè)脈)、花梗均密被開展絨毛，萼片反折，花瓣先端2裂，且自然分布在華東(浙江、福建)有部分重疊；不同特征為磐安櫻桃與尾葉櫻桃的花萼長約為萼筒的2倍，而浙閩櫻桃則是等長或稍長；磐安櫻桃與尾葉櫻桃花柱基部無毛、全株毛被均為黃棕色長柔毛，而浙閩櫻為花柱基部有毛，全株毛被為灰褐色微硬毛等等；鑒于陳子林等在發(fā)表時，僅將浙閩櫻桃與迎春櫻桃作為相似種，與磐安櫻桃進(jìn)行分子建樹比較；為了能夠得到更加全面和客觀的親緣關(guān)系證據(jù)，在本研究中，筆者由此在典型櫻亞屬中增加了相似種尾葉櫻桃種系(尾葉櫻桃和長柱尾葉櫻桃)以及遠(yuǎn)源分布的高盆櫻桃，參考相同的引物序列及擴(kuò)增體系獲得序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹重建，結(jié)果顯示：磐安櫻桃置于系統(tǒng)樹基部，可能處于較原始的進(jìn)化階段，但與浙閩櫻桃、尾葉櫻桃等其余物種構(gòu)成并系，因而在分子層面上較難區(qū)分；而基于單倍型的中介鄰接網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步顯示，磐安櫻桃與浙閩櫻桃突變步長最短，相比尾葉櫻桃，兩者具有更近的親緣關(guān)系。

3.3 長柱尾葉櫻桃分類地位的探討

長柱尾葉櫻桃是伊賢貴[23]在其2007年學(xué)位論文系統(tǒng)調(diào)查武夷山地區(qū)櫻屬資源基礎(chǔ)上記錄的新變種，與原變種尾葉櫻桃的主要差別在于其花柱長約為雄蕊的2倍，且花粉外壁紋飾種間亦稍有差別；王賢榮在2014年出版的《中國櫻花品種圖志》[1]認(rèn)為其與原變種的區(qū)別主要在于花柱明顯長于花冠，亦將其整理收錄。近年來，筆者在從事櫻屬專類調(diào)查研究時，又陸續(xù)在江西、安徽等地發(fā)現(xiàn)該種新分布地，遂將其一并采集與原變種進(jìn)行比較分析?；谌~綠體單倍型Network中介網(wǎng)絡(luò)圖顯示，長柱尾葉櫻桃檢測到一個單倍類型(Hap8)獨(dú)立于原變種尾葉櫻桃其余的3個單倍型，并與它們共同構(gòu)成一獨(dú)立進(jìn)化單元；而基于葉綠體片段的系統(tǒng)發(fā)育樹重建結(jié)果也表明，尾葉櫻桃與長柱尾葉櫻桃互為姊妹類群，且各支持度較高，因此，本研究從分子層面上支持上述學(xué)者的劃分意見，即同意將長柱尾葉櫻桃作為尾葉櫻桃的變種處理。