， ，

(榆林市第二醫(yī)院心血管內(nèi)科二病區(qū)，陜西 榆林 719000)

阿霉素(Adriamycin)是一類蒽環(huán)類的抗生素，具有廣譜的抗癌活性，能減緩乳腺癌、肺癌、膀胱癌及甲狀腺癌等癌癥的發(fā)展進(jìn)程，被廣泛地應(yīng)用于癌癥的治療，但其不良反應(yīng)限制了阿霉素的應(yīng)用[1-3]，其中心臟毒性是其最主要的不良反應(yīng)。研究表明，連續(xù)2～3 d使用阿霉素即可造成心肌損傷[4]，最終可發(fā)展為心律不齊和心臟衰竭，甚至導(dǎo)致患者死亡[5],因此探究阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)具有心肌保護(hù)作用的新藥物是降低阿霉素不良反應(yīng)的關(guān)鍵。有研究表明，自噬在調(diào)控心臟的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮了重要作用[6];也有研究表明，自噬是阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的主要作用機(jī)制之一，異常的自噬可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[7]。因此，抑制自噬可能有利于減輕阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷。冬凌草甲素(Oridonin)是從中藥冬凌草中提取的一類二萜類化合物，具有抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化活性，具有調(diào)控細(xì)胞自噬的作用[8-9]，但是否能通過(guò)調(diào)控自噬減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷還未見(jiàn)報(bào)道。本文采用阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并給予冬凌草甲素，探究冬凌草甲素對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞株H9C2由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。冬凌草甲素購(gòu)自河南濟(jì)世藥業(yè)，純度99.5%。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD，貨號(hào)：A001-1-1)和丙二醛(malondialdehyde,MDA，貨號(hào)：A003-1)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，CCK8試劑盒(貨號(hào)：C0037)和Annexin V-FITC試劑盒(貨號(hào)：C1063)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。RIPA裂解液(貨號(hào)：R0010)和BCA試劑盒(貨號(hào)：PC0020)購(gòu)自北京索萊寶科技公司。Beclin1(貨號(hào)：ab207612)、P62(貨號(hào)：ab109012)和LC3(貨號(hào)：ab192890)一抗及實(shí)驗(yàn)所用二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞分組及模型復(fù)制

用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞融化率達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為H9C2組、Adriamycin組、Oridonin(5 μM)組、Oridonin(10 μM)組和Oridonin(20 μM)組，每組6個(gè)復(fù)孔。除H9C2組外，其余組加入阿奇霉素進(jìn)行處理，使其終濃度為1 μM。同時(shí)，Oridonin(5 μM)組、Oridonin(10 μM)組和Oridonin(20 μM)組分別加入5 μM、10 μM和20 μM的冬凌草甲素，其余2組給予等量溶劑處理，48 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.3 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激分子的濃度

用冬凌草甲素處理細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞上清液，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心4 min后取上清液根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中抗氧化酶SOD和氧化產(chǎn)物MDA的濃度。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，同時(shí)加入1 μM的阿霉素和5 μM、10 μM、20 μM的冬凌草甲素分別處理0 d、1 d、2 d、3 d和4 d后，每孔加入10 μL的CCK8試劑，室溫孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)(增殖倍數(shù)=細(xì)胞吸光度/0 h H9C2組細(xì)胞吸光度×100%)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用阿霉素和冬凌草甲素處理細(xì)胞48 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用緩沖液清洗細(xì)胞3次并用胰酶收集細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106個(gè)/mL，用70%預(yù)冷的乙醇于4 ℃固定2 h后，加入PI染色液和FITC-Annexin V避光室溫孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度、調(diào)平。每組取等量蛋白，用10%SDS-PAGE分離蛋白，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5% BSA封閉蛋白，加入適宜濃度一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第2天洗去未結(jié)合一抗 (Beclin1∶1∶1 200;P62,1∶1 000;LC3,1∶1 000)，加入二抗室溫封閉1 h。隨后洗去未結(jié)合二抗，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影。

1.7 免疫熒光檢測(cè)LC3表達(dá)

將用冬凌草甲素處理后的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，隨后滴加TritonX-100對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行打孔。15 min后棄去TritonX-100，滴加10%封閉用山羊血清，室溫孵育2 h。封閉完成后，加入LC3一抗4 ℃封閉過(guò)夜，抗體濃度為1∶200。第2天洗去未結(jié)合一抗，加入FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶300)室溫孵育1 h，隨后洗去未結(jié)合二抗，滴加DAPI即用液室溫處理15 min，洗凈后于熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)氧化應(yīng)激的影響

與H9C2組比較，Adriamycin組細(xì)胞上清液中抗氧化酶SOD的濃度顯著降低，氧化產(chǎn)物MDA濃度顯著升高；與Adriamycin組比較，Oridonin(5,10,20 μM)組SOD濃度明顯升高，MDA濃度明顯降低，表明冬凌草甲素能抑制阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激(圖1)。

2.2 冬凌草甲素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與H9C2組比較，Adriamycin組細(xì)胞增殖速度明顯降低；用冬凌草甲素處理細(xì)胞4 d后，Oridonin(5,10,20 μM)組細(xì)胞增殖速度與Adriamycin組比較均明顯升高，表明冬凌草甲素能促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖(圖2)。

2.3 冬凌草甲素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素能顯著提高H9C2細(xì)胞的凋亡率，冬凌草甲素(5,10,20 μM)能顯著減弱阿霉素對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，表明冬凌草甲素能抑制心肌細(xì)胞凋亡(圖3、4)。

a：SOD濃度；b: MDA濃度 *：與H9C2組比較，P<0.01；#：與Adriamycin組比較，P<0.05；△：與Adriamycin組比較，P<0.01

圖1冬凌草甲素對(duì)上清液中SOD和MDA濃度影響

*：與H9C2組比較，P<0.01；#：與Adriamycin組比較，P<0.01；△：與Adriamycin組比較，P<0.01

圖2冬凌草甲素對(duì)H9C2細(xì)胞增殖的影響

a:H9C2組;b:Adriamycin組;c:Oridonin(5 μM)組;d:Oridonin(10 μM)組;e:Oridonin(20 μM)組

*：與H9C2組比較，P<0.01；#：與Adriamycin組比較，P<0.05；△：與Adriamycin組比較，P<0.01

圖4冬凌草甲素對(duì)H9C2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 冬凌草甲素對(duì)自噬的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與H9C2組比較，Adriamycin組細(xì)胞Beclin1表達(dá)水平和LCⅡ/LC3Ⅰ的比值明顯升高，P62表達(dá)水平明顯降低；與Adriamycin組比較，Oridonin(5,10,20 μM)組細(xì)胞Beclin1表達(dá)水平和LCⅡ/LC3Ⅰ的比值明顯降低，Oridonin(10, 20 μM)組P62表達(dá)水平明顯升高(圖5)。同時(shí)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Adriamycin組細(xì)胞LC3的表達(dá)量顯著高于H9C2組，Oridonin(5,10,20 μM)組細(xì)胞LC3表達(dá)量明顯高于Adriamycin組，表明冬凌草甲素能減弱阿霉素誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞自噬(圖6、7)。

a:Western blot檢測(cè)；b：蛋白相對(duì)表達(dá)量分析 *：與H9C2組比較，P<0.01；△：與Adriamycin組比較，P<0.01

圖5Westernblot檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)Beclin1、P62和LC3蛋白表達(dá)的影響

圖6 免疫熒光檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)LC3表達(dá)量的影響

*：與H9C2組比較，P<0.01；△：與Adriamycin組比較，P<0.01

3 討論

阿霉素是一類蒽環(huán)類藥物，臨床常用于各類癌癥的治療，但因其具有較強(qiáng)的心臟毒性而限制了應(yīng)用[10-11]。研究表明，15～25 mg/kg的阿霉素即具有心臟毒性，24 mg/kg及以上劑量的阿霉素可導(dǎo)致小鼠心臟嚴(yán)重?fù)p傷[12]。靜脈連續(xù)給予癌癥患者阿霉素?cái)?shù)月可導(dǎo)致左心室重構(gòu)，發(fā)展為慢性心肌病和充血性心力衰竭，導(dǎo)致患者死亡[13]。臨床研究表明，心肌阿霉素積累量達(dá)到650 mg/m2的患者中有超過(guò)70%的患者都會(huì)發(fā)生充血性心力衰竭[3]。目前只能通過(guò)降低阿霉素使用劑量、終止阿霉素使用和與右雷佐生聯(lián)用減輕阿霉素的心臟毒性[14]，并且還沒(méi)有研究證明這些方法及藥物既能顯著改善阿霉素的心臟毒性又能不影響阿霉素的抗癌活性。因此，尋找降低阿霉素心臟毒性的新方法及新藥物顯得尤為重要。冬凌草甲素是中藥冬凌草的有效成分之一，研究表明冬凌草甲素具有廣譜的抗癌活性，并且能防止放射治療的副反應(yīng)，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[15-16]。但冬凌草甲素是否能減輕抗癌藥物阿霉素的心臟毒性還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用阿霉素直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷并給予不同劑量的冬凌草甲素，以期探究冬凌草甲素對(duì)阿霉素心臟毒性的作用。

氧化應(yīng)激是阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的主要機(jī)制之一。研究表明，阿霉素的使用可誘導(dǎo)線粒體活性氧的大量產(chǎn)生和心肌的損傷[17]。大量氧化自由基可造成細(xì)胞線粒體功能障礙和DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[18]。心肌細(xì)胞凋亡和壞死是導(dǎo)致心功能衰竭的最直接原因[19]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥提取物黃芪素能通過(guò)減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激抑制小鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕阿霉素對(duì)小鼠的心毒性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能顯著升高阿霉素處理后細(xì)胞上清液中SOD的濃度，降低MDA的濃度。SOD是一類抗氧化酶，能夠通過(guò)清除氧化自由基減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中的一類重要的中間產(chǎn)物，與氧化損傷程度呈正相關(guān)，提示冬凌草甲素能減弱阿霉素誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激。此外，阿霉素還能顯著抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡，冬凌草甲素能減輕阿霉素對(duì)心肌細(xì)胞增殖和凋亡的作用，并具有劑量依耐性，表明冬凌草甲素能對(duì)抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞凋亡，并隨濃度升高作用逐漸增強(qiáng)，提示冬凌草甲素可能具有減輕阿霉素化療所帶來(lái)的心臟毒性的作用。

自噬是清除蛋白質(zhì)聚集體和受損細(xì)胞器的重要機(jī)制。在正常生理?xiàng)l件下，自噬可維持心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，異常的自噬可導(dǎo)致心肌細(xì)胞細(xì)胞器損傷及心肌細(xì)胞的凋亡和壞死[21]。已有研究表明，自噬在阿霉素導(dǎo)致的心功能衰竭過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[22]。Beclin1是自噬體形成的重要調(diào)節(jié)蛋白之一，與LC3共同參與自噬體的形成[23]。研究表明，Beclin1在自噬體的形成的啟動(dòng)階段發(fā)揮重要作用，能誘導(dǎo)LC3Ⅰ向LCⅡ轉(zhuǎn)化，參與自噬溶酶體膜的延伸，指導(dǎo)自噬體的形成，因此常被作為自噬體形成的標(biāo)志[24]。P62則主要參與蛋白質(zhì)的泛素化，隨著自噬的進(jìn)行不斷地被降解，表達(dá)水平與自噬呈負(fù)相關(guān)[24]。本研究中，Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明阿霉素能顯著升高心肌細(xì)胞H9C2的Beclin1蛋白表達(dá)水平和LCⅡ/LC3Ⅰ的比值，抑制P62的表達(dá)，表明阿霉素誘導(dǎo)了H9C2細(xì)胞自噬。冬凌草甲素能顯著減弱阿霉素對(duì)Beclin1、LCⅡ/LC3Ⅰ和P62的調(diào)控作用，提示冬凌草甲素能抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬。

綜上所述，冬凌草甲素能升高阿霉素處理后H9C2細(xì)胞上清液中SOD的濃度，降低MDA濃度，并促進(jìn)H9C2增殖、抑制細(xì)胞凋亡；同時(shí)，冬凌草甲素還能顯著減弱阿霉素對(duì)Beclin1、LCⅡ/LC3Ⅰ和P62的調(diào)控作用和阿霉素對(duì)LC3表達(dá)的促進(jìn)作用，表明冬凌草甲素能抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和自噬，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究首次初步探究了冬凌草甲素對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制，提示冬凌草甲素可能改善阿霉素用于癌癥患者治療的不良反應(yīng)，為臨床減輕阿霉素心臟毒性副作用提供了新的潛力藥物。