高瑞娟，王純潔，敖日格樂(lè)，高思明

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）屬腸桿菌科埃希氏菌屬，為革蘭陰性桿菌，特定血清型的大腸桿菌具有致病性。動(dòng)物大腸桿菌病是指由大腸桿菌埃希氏菌屬的某些致病性血清型菌株引起的動(dòng)物疾病總稱。該病一年四季均可發(fā)生，主要對(duì)犢牛、仔豬等幼齡動(dòng)物威脅最大，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。從1982年開始，美國(guó)、英國(guó)、加拿大、澳大利亞、日本等國(guó)家多次發(fā)生大腸桿菌O157∶H7感染人的病例［1］，即便是在經(jīng)濟(jì)日益發(fā)達(dá)、食品污染控制技術(shù)日益成熟的現(xiàn)代社會(huì)，大腸桿菌在各國(guó)感染人的病例時(shí)有發(fā)生［2］。抗生素是治療細(xì)菌感染性疾病的首選藥物，但是由抗生素不合理使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已成為人類公共衛(wèi)生安全面臨的又一道難題，尤其是腸道中大量存在的致病菌，更容易引起耐藥基因的傳遞。楊斯琴等［3］研究表明，不同血清型的牛源大腸桿菌對(duì)7～12種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，并且有10種血清型的致病性大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、利福平、復(fù)方新諾明和阿莫西林等抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。此外，由于新型抗生素的研究與開發(fā)不但耗資、耗時(shí)，更重要的是其研制速度遠(yuǎn)不及耐藥菌株形成的速度，因此，篩選、開發(fā)新型抗菌藥物具有緊迫性。

蒙藥具有悠久的歷史，是蒙古民族傳承的瑰寶，除了具有藥用、保健、營(yíng)養(yǎng)等作用外，還以低毒、殘留少、耐藥性發(fā)生率低等特點(diǎn)著稱。此外，蒙藥在抑菌和抗炎等方面均有良好的效果。吳海燕等［4］研究表明，小鼠對(duì)蒙藥特潤(rùn)舒都樂(lè)復(fù)方最大耐受量達(dá) 120 000 mg/（kg·BW），基本無(wú)毒。研究表明，一些蒙藥的抑菌活性高，且不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。楊斯琴等［3］研究表明，朱如拉、朝您—哈日莫各等7味蒙藥對(duì)4種不同血清型致病性大腸桿菌均達(dá)到極敏和高敏。因此，研究和開發(fā)抗菌蒙藥對(duì)解決耐藥菌株的產(chǎn)生和新型抗生素短缺問(wèn)題具有重要意義。

該研究擬選用烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇等16味具有清熱、解毒、抗菌、消炎作用的蒙藥作為研究對(duì)象，利用煎煮法提取藥液，通過(guò)測(cè)定這些藥物對(duì)3種血清型大腸桿菌的MIC和MBC來(lái)評(píng)價(jià)蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌的體外抑菌活性，從而篩選具有較好抗菌活性的蒙藥，并通過(guò)體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)推薦組方藥物，以期為抗大腸桿菌蒙獸藥的開發(fā)、利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1藥材：蒙藥烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇（金銀花）、協(xié)日—洪連（黃連）、希木圖—希木蕾（何首烏）、呼仍—圖如（地榆）、烏拉勒吉嘎納（五味子）、木合圖—毛敦—哈力蘇 （秦皮）、乃日—泰勒格其—額布蘇（穿心蓮）、希和日—烏布斯（甘草）、畢力格圖—那布其（蒲公英）、寶日—吉如格（夏枯草）、舒布格日—希木勒德格（虎杖）、包日查—額布蘇（柴胡）、協(xié)日—毛敦—道日素（黃柏）、道古勒—烏布斯（苦參）、阿納爾（石榴皮）、呼胡日格那—溫都蘇（板藍(lán)根）均購(gòu)自內(nèi)蒙古呼和浩特市天力藥業(yè)有限公司。所有藥物經(jīng)鑒定均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2受試菌株：致病性大腸桿菌 O26、O83、O145均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院牛生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室從腹瀉犢牛糞便中分離、鑒定。

1.1.3儀器與試劑：超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱 （型號(hào)為JCSPJ-480），濟(jì)南精誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。電子分析天平 （型號(hào)為CP224C），微量移液，無(wú)菌玻璃平皿，無(wú)菌牛津杯，無(wú)菌96孔板，電爐、漏斗等實(shí)驗(yàn)室常用器材。甘露醇瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基等購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1蒙藥提取液的制備：采用水提法。將蒙藥粉碎成末后分別稱取各單味蒙藥50 g倒入濾藥袋，加入500 mL蒸餾水室溫浸泡過(guò)夜，大火煮沸后文火煮1 h，8層紗布過(guò)濾藥液，濾渣中加入250 mL蒸餾水，煮沸30 min，過(guò)濾后合并2次藥液，小火濃縮至50 mL（即藥液中所含生藥量為1 g/mL）。裝瓶、標(biāo)記，121℃高壓滅菌，置于4℃冰箱備用［5］。

1.2.2菌懸液的制備：將凍存于-80℃冰箱中的E.coli O26、O83、O145在營(yíng)養(yǎng)肉湯中復(fù)蘇、增殖、純化后保存于瓊脂斜面。將純化后的細(xì)菌接種在瓊脂培養(yǎng)基上，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)20 h后，用3 mL無(wú)菌生理鹽水將菌苔洗下，收集于無(wú)菌試管中（即原菌液）。將原菌液10倍稀釋5個(gè)梯度。于630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液OD值。OD值在0.08～0.10的菌液濃度為 1×108cfu/mL。

1.2.3牛津杯法抑菌試驗(yàn)：于超凈工作臺(tái)內(nèi)，取調(diào)好的1.0×108cfu/mL菌液100 μL均勻涂布于無(wú)菌瓊脂表面。無(wú)菌操作將高壓滅菌的牛津杯放置于帶有菌層的平皿內(nèi)，將200 μL的藥液加入牛津杯內(nèi)，放置于4℃冰箱中過(guò)夜（使藥液在瓊脂上均勻擴(kuò)散），于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。每種藥物做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值［6］。 抑菌圈直徑（R）≥15 mm，判定為極敏；10 mm≤R＜15 mm， 判定為高敏；8 mm≤R＜10 mm 判定為低敏；R＜8 mm為不敏感。

1.2.4MIC及MBC測(cè)定：采用微量稀釋法和平板法，取96孔板，每排1～8孔為試驗(yàn)孔，加入用肉湯2倍稀釋的藥液，每孔200 μL，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔（第9孔，不加藥物）和陰性對(duì)照孔（第10孔，不加菌液）。在第 1～9孔中加入 100 μL稀釋好的 1.0×108cfu/mL菌液。振蕩混勻后放置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。以陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔作為參照判定結(jié)果。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)且藥物濃度最低者即為該味蒙藥對(duì)該菌株的最低抑菌濃度（MIC）。從未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各孔取100 μL混合液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24 h，生長(zhǎng)的菌落數(shù)小于5～10個(gè)的最低藥液濃度為最低殺菌濃度（MBC）［7］。MIC＜7.80 mg/mL，判定為高度敏感；7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL，判定為中度敏感；MIC＞250 mg/mL，判定為不敏感［8］。

表1 16味蒙藥對(duì)大腸桿菌O26、O83、O145的體外抑菌直徑測(cè)定結(jié)果mm

1.2.5體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)：將1.2.3和1.2.4中篩選出的對(duì)致病性大腸桿菌O26、O83、O145抑菌效果較好的蒙藥，用無(wú)菌肉湯倍比稀釋成2×MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIIC 共 5個(gè)梯度。將制備好的蒙藥按棋盤法設(shè)計(jì)，測(cè)定MIC［9］。觀察結(jié)果并計(jì)算協(xié)同指數(shù)FICI。FICI=MIC（甲藥聯(lián)合）/MIC（甲藥單藥）+MIC （乙藥聯(lián)合）/MIC （乙藥單藥）。FICI≤0.50，判定為協(xié)同作用；0.50＜FICI≤1.00，判定為累加作用；1.00≤FICI≤2.00，判定為無(wú)關(guān)；FICI＞2.00，判定為頡頏作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 16 味蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌 O26、O83、O145抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果

由表1可知，大腸桿菌O26對(duì)烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、烏拉勒吉嘎納極度敏感，其抑菌圈直徑分別為19.80、20.74、24.46 mm，對(duì)木合圖—毛敦—哈力蘇、畢力格圖—那布其、寶日—吉如格高度敏感，其抑菌圈直徑分別為13.08、11.50、12.04 mm，對(duì)希和日—烏布斯、包日查—額布蘇、乃日—泰勒格其—額布蘇等其他蒙藥不敏感；大腸桿菌O83對(duì)烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、烏拉勒吉嘎納極度敏感，其抑菌圈直徑分別為16.10、29.64、23.47 mm，對(duì)木合圖—毛敦—哈力蘇、畢力格圖—那布其、寶日—吉如格低度敏感，其抑菌圈直徑分別為8.46、8.68、9.94mm，對(duì)希和日—烏布斯、包日查—額布蘇、乃日—泰勒格其—額布蘇等其他蒙藥不敏感；大腸桿菌O145對(duì)烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、烏拉勒吉嘎納極度敏感，其抑菌圈直徑分別為21.76、28.51、24.74 mm，對(duì)木合圖—毛敦—哈力蘇、畢力格圖—那布其、寶日—吉如格高度敏感，其抑菌圈直徑分別為13.82、11.62、11.74 mm，對(duì)希和日—烏布斯、包日查—額布蘇、乃日—泰勒格其—額布蘇等其他蒙藥不敏感。

表2 16種蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌O26、O83、O145的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果mg/mL

表3 敏感蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌O26的FICI計(jì)算結(jié)果

2.2 16味蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌 O26、O83、O145 MIC和MBC測(cè)定結(jié)果

由表2可知，大腸桿菌O26對(duì)烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、希木圖—希木蕾、呼仍—圖如、烏拉勒吉嘎納、木合圖—毛敦—哈力蘇、畢力格圖—那布其、寶日—吉如格、舒布格日—希木勒德格、阿納爾中度敏感，各藥物對(duì)大腸桿菌 O26的 MIC 為 15.63～250 mg/mL，MBC 為125～500 mg/mL；大腸桿菌O83對(duì)烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、希木圖—希木蕾、呼仍—圖如、烏拉勒吉嘎納、乃日—泰勒格其—額布蘇、阿納爾中度敏感，各藥物對(duì)大腸桿菌O83的MIC 為 15.63～250 mg/mL，MBC 為 125 mg/mL （希木圖—希木蕾未測(cè)出）；大腸桿菌O145對(duì)烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、希木圖—希木蕾、呼仍—圖如、烏拉勒吉嘎納、木合圖—毛敦—哈力蘇、畢力格圖—那布其、寶日—吉如格、協(xié)日—毛敦—道日素、阿納爾對(duì)中度敏感，各藥物對(duì)大腸桿菌O145的 MIC為7.81～250 mg/mL，MBC為15.63～500 mg/mL。

2.3 敏感蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌O26、O83、O145FICI測(cè)定結(jié)果

由表3可知，對(duì)于大腸桿菌O26，烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇與協(xié)日—洪連、呼仍—圖如，呼仍—圖如與協(xié)日—洪連、烏拉勒吉嘎納的FICI均為2.25～4.00，表現(xiàn)為頡頏作用；烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇與烏拉勒吉嘎納，協(xié)日—洪連與舒布格日—希木勒德格的FICI為0.75，表現(xiàn)為累加作用；協(xié)日—洪連與烏拉勒吉嘎納，呼仍—圖如與舒布格日—希木勒德格的FICI為0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用；舒布格日—希木勒德格與烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、烏拉勒吉嘎納的FICI為1.00～1.50，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。由表4可知，對(duì)于大腸桿菌O83，烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇與協(xié)日—洪連、呼仍—圖如，協(xié)日—洪連與呼仍—圖如的FICI為1.00～1.25，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用；烏拉勒吉嘎納與協(xié)日—洪連、呼仍—圖如的FICI為2.25，表現(xiàn)為頡頏作用；烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇與烏拉勒吉嘎納的FICI為0.50，表現(xiàn)為協(xié)同作用。由表5可知，對(duì)于大腸桿菌O145，烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇與協(xié)日—洪連、烏拉勒吉嘎納的FICI為1.25，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用；阿納爾與協(xié)日—洪連、呼仍—圖如、烏拉勒吉嘎納的FICI為1.25，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用；烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇與呼仍—圖如、阿納爾的FICI為2.25，表現(xiàn)為頡頏作用；烏拉勒吉嘎納與協(xié)日—洪連、呼仍—圖如的FICI為3.00，表現(xiàn)為頡頏作用；協(xié)日—洪連與呼仍—圖如的FICI為1.00，表現(xiàn)為累加作用。

表4 敏感蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌O83的FICI計(jì)算結(jié)果

表5 敏感蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌O145的FICI計(jì)算結(jié)果

3 討論

該研究結(jié)果表明，16味蒙藥對(duì)3種血清型致病性大腸桿菌表現(xiàn)出不同的抗菌作用。當(dāng)藥物濃度為1 g/mL時(shí)，烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、烏拉勒吉嘎納、希木圖—希木蕾、呼仍—圖如、阿納爾對(duì)致病性大腸桿菌O26、O83、O145的MIC為7.81～250 mg/mL，均表現(xiàn)出較好的抑菌作用，組方時(shí)可優(yōu)先考慮。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，不同單味蒙藥對(duì)同種血清型細(xì)菌的抑菌作用存在差異，究其原因可能與菌種的毒力有關(guān)［5-6］。

不同研究者對(duì)同一種藥物體外抑菌效果的研究結(jié)果不同。陳微等［9］報(bào)道黃柏對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有很好的抑菌活性，但在該研究中，協(xié)日—毛敦—道日素（黃柏）對(duì)大腸桿菌O26、O83、O145的抑菌效果并不好，這可能與藥液的pH值及菌種自身毒力有關(guān)。陳輝等［10］研究表明，不同pH值的藥液對(duì)同一種細(xì)菌的抑菌效果存在較大差異。代如意等［8］報(bào)道了虎杖對(duì)雞白痢沙門菌具有很好的抑殺效果，但該研究中舒布格日—希木勒德格（虎杖）僅對(duì)大腸桿菌O26表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌O83、O145無(wú)抑菌作用，結(jié)果不同的原因可能是由于藥物提取方式和提取劑不同導(dǎo)致。代如意等［8］用乙醇提取藥物濃縮浸膏，而該研究采用的是基礎(chǔ)水提液，該種方法可能會(huì)導(dǎo)致藥物抗菌有效成分析出不全，使藥物抑菌效果降低。有研究表明，草藥的提取工藝、提取劑分別決定和影響藥液的成分及其含量［11］。 陳輝等［10］研究發(fā)現(xiàn)，五味子對(duì)溶藻弧菌的抑菌作用達(dá)到極敏，與該研究結(jié)果基本相同。該研究的2個(gè)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果均表明，烏拉勒吉嘎納（五味子）對(duì)大腸桿菌O26、O83、O145的體外抑菌作用均達(dá)到極敏或中敏。陳輝等［10］的進(jìn)一步研究指出，五味子的酸性提取液抑菌效果強(qiáng)于堿性提取液，所以筆者推測(cè)五味子的抑菌作用可能與其提取物中的酸性物質(zhì)有關(guān)。

該研究同時(shí)采用牛津杯和微量稀釋2種方法來(lái)評(píng)價(jià)16味蒙藥對(duì)致病性大腸桿菌O26、O83、O145的抑菌效果，2種方法的結(jié)合分別從定性和定量角度準(zhǔn)確檢測(cè)藥物的抑菌效果，避免了單獨(dú)使用一種方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的片面性［12］。由試驗(yàn)結(jié)果可知，2種方法測(cè)得16味蒙藥的抑菌效果大部分相同，但也存在一定差異。楊斯琴等［13］、阿琪瑪?shù)龋?4］研究表明，微量稀釋和牛津杯法測(cè)定藥物體外抑菌效果的試驗(yàn)結(jié)果大致相同，但存在一定差異，研究結(jié)果與該研究結(jié)果一致。該研究在測(cè)定藥物抑菌圈結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，希木圖—希木蕾、呼仍—圖如、舒布格日—希木勒德格、阿納爾4味蒙藥水提液不能滲入培養(yǎng)基中，導(dǎo)致4味蒙藥沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，所以牛津杯法不能確定這4味蒙藥有無(wú)抑菌作用；但在微量稀釋法中，希木圖—希木蕾、呼仍—圖如、舒布格日—希木勒德格、阿納爾4味蒙藥均有抑菌作用，其MIC為31.25～250 mg/mL，其中呼仍—圖如和舒布格日—希木勒德格的MIC達(dá)到31.25 mg/mL，表現(xiàn)出很好的抑菌作用，所以微量稀釋法彌補(bǔ)了牛津法的不足。2種體外試驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能與藥物溶解度有關(guān)。在抑菌圈測(cè)定試驗(yàn)中，牛津杯中的藥物如果不能滲入培養(yǎng)基，藥物無(wú)法發(fā)揮抑菌作用，但微量稀釋法不受藥物溶解度的影響，在96孔板中，藥物和細(xì)菌充分混勻，加大了藥物和細(xì)菌的接觸面積，藥效可以充分發(fā)揮。在微量稀釋法中，藥物與細(xì)菌直接接觸產(chǎn)生對(duì)抗作用，這與體內(nèi)藥物作用模式相似，易于反映臨床應(yīng)用效果，且藥物的MIC還可指導(dǎo)臨床用藥劑量［15］。

該研究結(jié)果表明，不同蒙藥水提液對(duì)不同血清型大腸桿菌均表現(xiàn)出不同的聯(lián)合效應(yīng)，烏里史古—達(dá)蘭—哈力蘇、協(xié)日—洪連、呼仍—圖如、烏拉勒吉嘎納、舒布格日—希木勒德格5味蒙藥對(duì)大腸桿菌O26均有一定的抑菌作用，MIC范圍在15.63～31.25 mg/mL，其中烏拉勒吉嘎納與協(xié)日—洪連，舒布格日—希木勒德格與呼仍—圖如的FICI為0.50，有協(xié)同作用，組方時(shí)可優(yōu)先選用上述藥物。

蒙藥對(duì)病原菌的抑制效果衡量標(biāo)準(zhǔn)由體外的藥物對(duì)細(xì)菌抑菌圈、MIC、MBC的測(cè)定和體內(nèi)免疫機(jī)能的測(cè)定組成。該研究獲得了16味蒙藥對(duì)3種血清型致病性大腸桿菌體外抑菌作用及敏感蒙藥聯(lián)合抑菌效果的數(shù)據(jù)，為今后尋求高效且適合臨床應(yīng)用的治療藥物奠定了前期基礎(chǔ)，同時(shí)也為蒙藥組方制劑的研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)今后實(shí)際生產(chǎn)中動(dòng)物大腸桿菌病的預(yù)防與治療具有一定的指導(dǎo)意義。