包騏林，王丹，陸葵青，申雨燕，周明明，李云，*

（1.四川大學華西公共衛(wèi)生學院，四川成都610041；2.鄭州市中心醫(yī)院，河南鄭州450000）

桂花（Osmantus fragrans）是木犀科木犀屬小喬木，是我國特產(chǎn)的珍貴芳香觀賞花卉，其花氣味清香有很好的食用以及藥用價值[1]。四川地區(qū)是我國桂花的原產(chǎn)地之一，長期以來將桂花作為觀賞樹種用于園林綠化[2]。本次研究所使用的桂花為常見品種——日香桂，采摘自四川江油萬畝桂花產(chǎn)業(yè)園。該產(chǎn)業(yè)園桂花資源豐富，但對其的加工利用除傳統(tǒng)的曬制，泡制以外，在其它深加工方面有限。而桂花中含有黃酮、多糖、脂肪酸、酚類等多種生物活性成分[3-5]。其中黃酮化合物含量豐富[6-7]，根據(jù)多種研究表明，黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、治療心血管疾病等多種生理活性作用[8-11]。目前對桂花中黃酮類化合物的研究大部分集中于提取、含量測定等方面，對其體內(nèi)外抗氧化活性的研究有限。本次研究以桂花黃酮清除自由基和對鐵離子的還原能力為指標評價其體外抗氧化活性水平，以建立D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型為研究對象，探究桂花黃酮類化合物在機體內(nèi)的抗氧化能力，為進一步開發(fā)利用四川江油萬畝桂花產(chǎn)業(yè)園中桂花資源以及為當?shù)亟?jīng)濟產(chǎn)業(yè)的發(fā)展拓展新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂花：品種為日香桂，采摘于江油市萬畝桂花產(chǎn)業(yè)園。

亞硝酸鈉、過硫酸鉀：成都市科龍化工試劑廠；硝酸鋁：天津致遠化學試劑有限公司；蘆丁：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、D-半乳糖：美國Sigma公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

SPF級雄性昆明種小鼠50只，體重25g～30 g，8周齡，購自成都達碩生物科技有限公司，動物合格證：SCXK（川）2014-028。

HSY-SP電熱恒溫水浴箱：北京市永光明醫(yī)療器械廠；GZD-D400-BS-Ⅱ電熱恒溫干燥器：上海越近醫(yī)療器械廠；Multiskan GO自動酶標讀數(shù)儀：美國Thermo Fisher科技有限公司；Thermo ST16低溫高速離心機：美國Thermo Fisher科技有限公司；ICC50HD顯微鏡：德國Leica Microsystems有限公司；HHSYZL-Ni電熱恒溫水浴箱：北京長風儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 桂花黃酮的提取

新鮮桂花用烘箱烘干，粉碎，于干燥器中常溫保存。采用乙醇回流法提取桂花中的黃酮類化合物，稱取一定質(zhì)量的桂花干粉，按照料液比140（g/mL）加入60%的乙醇，回流提取3 h，提取溫度為70℃，過濾得濾渣后重復提取濾渣一次，合并濾液得到桂花黃酮提取液，于70℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流乙醇并濃縮，得到桂花黃酮溶液。

1.2.2 桂花中黃酮化合物含量的測定

準確稱取蘆丁標準品20 mg，用30%乙醇溶解，將蘆丁標準品配制成濃度為0.1 mg/mL的標準溶液備用。取蘆丁標準液 0、1、2、3、4、5 mL 分別移入 10 mL 容量瓶中，各加入0.4 mL的5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，混勻，放置6 min；最后加入4%NaOH溶液4 mL，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min后在波長510 nm處測定吸光度，空白參比溶液為30%乙醇溶液。橫坐標（X）為蘆丁標準溶液的濃度C，縱坐標（Y）為吸光度A，繪制標準曲線，并得到回歸方程。取1 mL的桂花黃酮溶液置于10 mL容量瓶中，按照繪制標準工作曲線的方法，測定吸光度，按照回歸方程計算出樣品桂花溶液中總黃酮的含量。

1.2.3 清除DPPH自由基的能力的測定[12]

準確稱取20 mgDPPH，用少量無水乙醇溶解后，移至250 mL容量瓶中用無水乙醇定容，配置成濃度為2×10-4mol/L 的溶液。移取 100 μL 濃度為 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液于96孔板中，之后加入不同濃度的桂花黃酮溶液100 μL。混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min于517 nm處測定各孔吸光度，以同樣濃度系列的抗壞血酸為陽性對照，以同樣的方法測定吸光度值。按照以下公式計算DPPH·的清除率。

式中：A0為 100 μLDPPH 溶液+100 μL 無水乙醇的吸光度值；A1為100 μLDPPH 溶液+100 μL 桂花黃酮溶液的吸光度值；A2為100 μL桂花黃酮溶液+100 μL無水乙醇的吸光度值。

1.2.4 清除ABTS+自由基的能力的測定[13]

將7.4 mmol/L的ABTS與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，于室溫下避光放置12 h～16 h制得ABTS+儲備液。使用前用無水乙醇稀釋，得在734 nm下測量吸光度在0.7±0.02之間的ABTS+工作液。以50%的乙醇為溶劑稀釋樣品，取2.4 mL ABTS+工作液與0.6 mL不同濃度樣品，混勻，室溫反應(yīng)6 min后迅速測定734 nm處各管的吸光度值。以抗壞血酸為陽性對照。根據(jù)以下公式計算ABTS+·的清除率。

式中：A0為50%的無水乙醇為空白加入ABTS+工作液后測定的吸光度值；A1為不同濃度的待測樣品與ABTS+工作液反應(yīng)后的吸光度值。

1.2.5 還原能力的測定[14]

在試管中依次加入1 mL不同濃度的桂花黃酮溶液，再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽溶液（pH=6.6），混勻后于50℃恒溫水浴20 min后急速冷卻。加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后在3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入5 mL蒸餾水和1%氯化鐵溶液后震蕩混勻，靜置10 min，于700 nm波長處測定各管吸光度值。根據(jù)吸光度值大小評價物質(zhì)的還原能力，所測吸光度越大，還原能力越強。

1.2.6 桂花黃酮體內(nèi)抗氧化作用研究

將50只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，按體重隨機分為5組，分別為空白組、模型組、桂花黃酮高、中、低劑量組。除空白組以外，其余各組按照小鼠體重以500 mg/kg的劑量與頸背部皮下注射D-半乳糖，空白組小鼠注射等量生理鹽水。造模同時，3個實驗組經(jīng)口灌胃分別給予不同劑量的桂花黃酮溶液，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。劑量設(shè)計與分組如表1所示。

表1 動物實驗劑量設(shè)計及分組Table 1 Dose design and grouping in animal exprements

按照上述的方法，連續(xù)培養(yǎng)6周后，小鼠禁食不禁水24 h，摘取眼球取血后立即頸椎脫臼處死，迅速剖出肝臟、腎臟、脾臟、腦組織稱重并計算其臟器系數(shù)，計算公式為：

取小鼠部分肝臟，固定、進行蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE），觀察肝細胞排列形態(tài)大小間隙等。按照相應(yīng)試劑盒說明，測定小鼠肝、腎組織勻漿中蛋白質(zhì)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（GSH）的活力以及小鼠血清和肝、腎組織勻漿中丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

根據(jù)蘆丁濃度和吸光度繪制標準曲，如圖1，得到濃度和吸光度值得回歸方程：Y=0.574 3X+0.004 9，（R2=0.999）。再測定桂花黃酮溶液的吸光度值，根據(jù)回歸方程得到其中桂花提取液中總黃酮的濃度。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standrad curve of rutin

2.2 DPPH自由基清除試驗

DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2 對DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of DPPH radical

由圖2可知，桂花總黃酮清除DPPH自由基的能力在0～0.08 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加而增強，當濃度大于0.08 mg/mL時，清除率增長較緩慢，逐漸趨于穩(wěn)定接近于抗壞血酸清除DPPH自由基的能力。說明桂花總黃酮具有一定清除DPPH自由基的能力。DPPH·是一種以氮為中心的自由基，易溶于醇溶液并呈紫色，當加入自由基清除劑時，DPPH自由基與其發(fā)生反應(yīng)，可以通過在517 nm處比較溶液吸光值的變化評價物質(zhì)的抗氧化能力。劉軍海等[15]在評價桂花殘渣中總黃酮抗氧化能力時發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)桂花總黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增強并且趨于穩(wěn)定與本試驗相同，但當桂花殘渣總黃酮的質(zhì)量濃度達到0.06 mg/mL時其抗氧化能力優(yōu)于抗壞血酸與本試驗不同，推測是因為桂花品種不同，提取黃酮的條件方式不同，提取原料不同所造成。郭嬌嬌等[16]研究表明桂花總黃酮提取物有良好的DPPH自由基清除能力與本試驗所得結(jié)果一致。

2.3 ABTS+自由基清除試驗

ABTS+自由基清除能力見圖3。

圖3 對ABTS+自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of ABTS+radical

由圖3可知，桂花黃酮對ABTS+自由基的清除效果與其濃度大小緊密相關(guān)，隨著桂花黃酮濃度的升高，對ABTS+自由基的清除能力也迅速增強。當桂花黃酮濃度低于0.12 mg/mL，隨著濃度的增加，對ABTS+自由基的清除能力也迅速增加，當濃度大于0.12 mg/mL時，桂花總黃酮對ABTS+自由基的清除能力增長緩慢逐漸接近于抗壞血酸清除ABTS+自由基的能力，并趨于穩(wěn)定。說明桂花總黃酮化合物能夠有效清除ABTS+自由基。

2.4 還原能力

還原能力與氧化活性之間有顯著的相關(guān)性，物質(zhì)的還原能力越強，越不容易被氧化，表示抗氧化能力越強，結(jié)果見圖4。

圖4 桂花總黃酮的還原能力Fid.4 Reducing capacity of TFOF

由圖4可知，桂花總黃酮化合物在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨桂花黃酮濃度的增加，對鐵離子的還原能力越強，說明桂花黃酮具有良好的還原能力。

2.5 體內(nèi)抗氧化作用研究

2.5.1 桂花黃酮對小鼠體征和臟器系數(shù)的影響

與正常小鼠對比，模型組小鼠明顯毛色稀疏且無光澤毛發(fā)易脫落，行動遲緩，有嗜睡現(xiàn)象；而正常小鼠毛發(fā)濃密有光澤，行動更敏捷。其余3個實驗組，高、中劑量組與正常組無明顯差別，而低劑量組毛色明顯稀疏灰暗。

臟器系數(shù)能初步反應(yīng)動物機體受到氧化損傷的程度，臟器系數(shù)與機體的衰老程度相關(guān)[17]。桂花黃酮對小鼠臟器系數(shù)的影響見表2。從表2可知，與空白組比較，模型組小鼠肝臟、腎臟、胸腺、腦系數(shù)都略有下降，其中肝臟、脾和胸腺系數(shù)與空白對照組相比均顯著降低（P＜0.05），說明D-半乳糖抑制了小鼠各臟器組織的生長并且使肝臟、脾、胸腺受到一定程度的損傷。與模型組相比，桂花黃酮高、中、低劑量組的各臟器系數(shù)略高于模型組，其中桂花黃酮高劑量組的肝臟和胸腺系數(shù)顯著增高，具有極顯著性差異（P＜0.01）。由此可以說明桂花黃酮在一定程度上可以修復D-半乳糖所致的損傷作用，或可以阻止D-半乳糖對小鼠生長的抑制作用。

表2 桂花黃酮對小鼠臟器系數(shù)的影響Table 2 Effects of TFOF on organs indexes in mice %

2.5.2 桂花黃酮對小鼠血清及臟器中MDA含量的影響

MDA是生物體內(nèi)最具有代表性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA的含量能夠反應(yīng)生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[18]。桂花黃酮對小鼠血清及臟器中MDA含量的影響見表3。

表3 桂花黃酮對小鼠血清及臟器中MDA含量的影響Table 3 Effects of TFOF on MDA contents in mice’s serum，liver and kidney

從表3中的實驗數(shù)據(jù)可以得出，與空白組相比較，模型組小鼠血清及肝臟組織中MDA的含量升高具有極顯著差異（P＜0.01），并且腎臟組織中MDA含量升高具有顯著差異（P＜0.05）；與模型組相比較，小鼠血清中，桂花高、中、低劑量組MDA含量均低于模型組且具有極顯著性差異（P＜0.01），在肝臟組織中，桂花黃酮中、高劑量組MDA含量較模型組低且具有極顯著性差異（P＜0.01），在腎臟組織中，桂花黃酮高劑量組的MDA含量較模型組極顯著降低（P＜0.01），說明桂花黃酮能降低D-半乳糖致衰小鼠體內(nèi)MDA的含量，降低機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而保護細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，并且隨桂花黃酮濃度增大，對機體的保護作用增強。

2.5.3 桂花黃酮對小鼠血清、肝臟及腎臟組織中SOD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在機體內(nèi)主要清除超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基是自由基鏈鎖反應(yīng)的前生物，SOD可將其除去是避免機體活性氧大量生成的第一道防線[19]。桂花黃酮對小鼠血清、肝臟及腎臟組織中SOD活性的影響見表4。

表4 桂花黃酮對小鼠血清、肝臟及腎臟組織中SOD活性的影響Table 4 Effects of TFOF on the activity of SOD in mice’s serum，liver and kidney

從表4實驗數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠的血清，肝臟和腎臟中SOD活性明顯降低，有極顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，血清中，桂花黃酮高劑量組小鼠SOD活性高于模型組，有極顯著性差異（P＜0.01）；在在肝臟組織中，桂花黃酮中、高劑量組SOD活性較模型組具有顯著差異（P＜0.05）；在腎臟組織中桂花黃酮高劑量組的SOD活性較模型組具有極顯著差異（P＜0.01）。本實驗表明，D-半乳糖可以通過降低小鼠血清、肝臟和腎臟中SOD的活性造成超氧陰離子等自由基在小鼠體內(nèi)大量累積，導致小鼠機體衰老損傷，而一定濃度的桂花黃酮可以提高小鼠體內(nèi)SOD的活性，清除機體中的有害物質(zhì)，修復D-半乳糖對小鼠機體造成損傷。

2.5.4 桂花黃酮對小鼠肝臟和腎臟中GSH的影響

GSH是組織中一種非蛋白的硫基化合物，可以通過硫基和自由基結(jié)合，穩(wěn)定含硫基的酶和防止血紅蛋白等受到氧化損傷[20]。桂花黃酮對小鼠肝臟和腎臟中GSH的影響見表5。

表5 桂花黃酮對小鼠肝臟和腎臟中GSH的影響Table 5 Effects of TFOF on the activity of GSH in mice’s liver and kidney μmol/gprot

從表5實驗數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟中GSH活性具有顯著差異（P＜0.05），腎臟中的GSH活性具有極顯著差異（P＜0.01）；與模型組相比較，桂花黃酮高劑量組小鼠肝臟和腎臟組織中GSH活性較模型組增加，且具有顯著性差異（P＜0.05）。表明一定濃度的桂花黃酮可以提高衰老小鼠體內(nèi)GSH的活性，清除機體內(nèi)多余的自由基，保護蛋白質(zhì)及相關(guān)抗氧化酶不受自由基的損害，從而維持細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

2.5.5 桂花黃酮對小鼠肝臟和腎臟組織中GSH-Px活力的影響

GSH-Px在機體內(nèi)能特異的催化GSH對過氧化氫的分解，從而阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低MDA的生成從而起到保護細胞膜功能和結(jié)構(gòu)的作用[21]。桂花黃酮隨小鼠肝臟和腎臟中GSH-Px的影響見表6。

表6 桂花黃酮隨小鼠肝臟和腎臟中GSH-Px的影響Table 6 Effects of TFOF on the activity of GSH-Px in mice’s liver and kidney U/gprot

如表6所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中的GSH-Px活力下降且具有極顯著差異（P＜0.01），腎臟組織中GSH-Px活性下降且具有顯著差異（P＜0.05）；與模型組小鼠相比，桂花黃酮高劑量組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性增加且具有極顯著差異（P＜0.01），桂花黃酮中劑量組小鼠腎臟組織中GSH-Px活性增高具有顯著差異（P＜0.05）并且高劑量組小鼠腎臟組織中GSH-Px活性增高具有極顯著差異（P＜0.01）。表明一定濃度的桂花黃酮可以提高D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠體內(nèi)GSH-Px的活性，增強GSH的功能，減少機體內(nèi)有害物質(zhì)的堆積，一定程度上修復D-半乳糖對小鼠造成的損傷。

2.5.6 小鼠肝組織病理學觀察

小鼠肝組織病理切片見圖5。

圖5 小鼠肝組織病理切片（100×）Fig.5 Pathological sections of liver in mice（100×）

空白對照組小鼠肝細胞無明顯變化，而模型組小鼠肝臟細胞形態(tài)排列紊亂，細胞間隙較大，可見脂肪變性，說明D-半乳糖破壞了小鼠的肝組織細胞結(jié)構(gòu)。與模型組比較，桂花黃酮中、低劑量組小鼠肝細胞仍可見脂肪細胞變性，而桂花黃酮高劑量組小鼠肝細胞排列整齊，未見脂肪變性。表明桂花黃酮可以改善D-半乳糖致衰老小鼠肝細胞的形態(tài)，減輕氧化反應(yīng)對細胞造成的損害，保護細胞正常生理功能，其修復能力與桂花黃酮的濃度有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究中體外試驗采用了DPPH法和ABTS法兩種最常用的評價物質(zhì)抗氧化性的試驗體系以及對鐵離子的還原能力的測定，證明了桂花黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性，據(jù)此可以將桂花黃酮作為天然抗氧化劑加以開發(fā)利用。體內(nèi)實驗證明，桂花黃酮類化合物能夠修復D-半乳糖對小鼠的損傷作用，提高機體的抗氧化能力，其機制與清除自由基，提高機體內(nèi)抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。本次研究通過較為系統(tǒng)的對桂花黃酮類化合物在體內(nèi)外抗氧化活性進行了評價為其以后在食品、藥品及保健品方面的應(yīng)用提供了理論和試驗基礎(chǔ)。