董揚(yáng)　張芬　王文標(biāo)

[摘要] 目的 探討槐果堿對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位（action potentials，AP）及離子電流的電生理效應(yīng)。 方法 將豚鼠心臟快速取出后通過(guò)心電圖記錄心臟對(duì)槐果堿的應(yīng)答；采用常規(guī)微電極技術(shù)對(duì)豚鼠乳頭狀肌或兔竇房結(jié)細(xì)胞快反應(yīng)及慢反應(yīng)動(dòng)作電位進(jìn)行記錄，研究槐果堿的相關(guān)效應(yīng)；獲取新生大鼠心室心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，采用膜片鉗技術(shù)記錄全細(xì)胞及單通道電流；采用穿孔膜片鉗技術(shù)進(jìn)行全細(xì)胞鈣流記錄。 結(jié)果 在異丙腎上腺素誘導(dǎo)后出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)速，而槐果堿（300 μmol）加入后，心動(dòng)過(guò)速或室顫現(xiàn)象消失，心電圖提示出現(xiàn)正常心跳。對(duì)于豚鼠心室心肌細(xì)胞的快反應(yīng)動(dòng)作電位，槐果堿作用后，APD及動(dòng)作電位的有效不應(yīng)期延長(zhǎng)，APA下降。對(duì)于竇房結(jié)的慢反應(yīng)動(dòng)作電位，槐果堿處理后，APA及Vmax均出現(xiàn)下降，且APD90也能夠延長(zhǎng)。結(jié)果顯示槐果堿通過(guò)阻斷Ikr而非Iks實(shí)現(xiàn)對(duì)APD的延長(zhǎng)。新生大鼠心室細(xì)胞的細(xì)胞電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10 μmol/L槐果堿能夠?qū)е翴Na下降約18%。且槐果堿能夠在全體細(xì)胞水平上降低慢內(nèi)向電流，尾部電流（外向K+電流）也出現(xiàn)消失，相比于對(duì)照組，ICaL在20 mV指令電位時(shí)，平均減少（33.2±11.7）%。 結(jié)論 槐果堿能夠逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素引起的心律失常，其作用機(jī)制為抑制Na離子、鈣離子及鉀離子電流。

[關(guān)鍵詞] 槐果堿；心肌細(xì)胞；動(dòng)作電位；離子電流

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）19-0026-05

Study on the electrophysiological mechanism of sophocarpine against arrhythmia

DONG Yang ZHANG Fen WANG Wenbiao LIU Jun

Department of Cardiology， Jinhua Peoples Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective To investigate the electrophysiological effects of sophocarpine on cardiomyocyte action potentials（AP） and ion currents. Methods The heart of guinea pigs was quickly removed and response of heart to sophocarpine was recorded by electrocardiogram. The conventional microelectrode technique was used to record the fast response and slow response action potentials of guinea pig papillary muscles or rabbit sinoatrial node cells， and the related effects of sophocarpine were investigated； neonatal rat ventricular cardiomyocytes were obtained for primary culture. Patch-clamp technique was used to record whole-cell and single-channel currents； perforated patch-clamp technique was used to record whole-cell calcium flow. Results Tachycardia occurred after isoproterenol induction， and after sophocarpine（300 μmol） was added， tachycardia or ventricular fibrillation disappeared. Electrocardiogram indicated a normal heartbeat. For ventricular cardiomyocytes fast response action potential in guinea pigs， after the sophocarpine was given， the effective refractory period of APD and action potential was prolonged， and APA was decreased. For the slow response action potential of the sinus node， after sophocarpine was given， APA and Vmax were both decreased. APD90 could also be prolonged. The results showed that sophocarpine extended APD by blocking Ikr instead of Iks. The experimental results of cell currents in neonatal rat ventricular cells showed that 10 μmol/L sophocarpine could cause INa to decrease by about 18%. Moreover， sophocarpine could reduce the slow inward current at the whole cell level. Tail current（outward K+ current） also disappeared. ICaL was decreased by an average of （33.2±11.7）% at a 20 mV command potential compared to the control group. Conclusion Sophocarpine can reverse isoproterenol - induced arrhythmia. Its mechanism of action is to inhibit the currents of Na+， Ca2+ and K+.

[Key words] Sophocarpine； Myocardial cells； Action potentials； Ion currents

心律失常是由離子通道異常引起的一種疾病，盡管已經(jīng)被研究多年，其迄今仍為一種能夠?qū)е律ｋU(xiǎn)的疾病[1-3]。有研究認(rèn)為心律失常由心臟病導(dǎo)致，如心衰和心肌缺血。心?；颊咄蛐膭?dòng)過(guò)速或室顫更易出現(xiàn)突發(fā)性心臟死亡。目前已有多種藥物被認(rèn)為能夠用于治療心律失常，然而這些藥物因其相關(guān)的副作用如心臟抑制及促心律失常效應(yīng)而使用受限[4-6]。近來(lái)研究提示，能夠避免這些嚴(yán)重心臟副作用的天然復(fù)合物可能能夠用于心律失常的治療[7-10]。

苦參作為一種中藥在中國(guó)已有千年的使用史。其包含多種類(lèi)型的生物堿，主要有苦豆堿、苦參堿及槐果堿[11，12]。有研究提示苦參具有抗心律失常的效應(yīng)。Zhang等[13]研究提示從苦參中提煉的槐果堿是一種治療病毒性心肌炎的有效藥物，其不僅具備抗病毒效應(yīng)，而且同時(shí)具備抗心律失常的效應(yīng)。Chen等[14]研究提示，期外收縮患者在采用槐果堿治療后，有89.7%的患者出現(xiàn)了心律失?；謴?fù)的情況。該結(jié)果提示槐果堿具有抗心律失常的效應(yīng)，然而有關(guān)其機(jī)制尚不明確。在本研究中，通過(guò)研究槐果堿對(duì)心臟、心肌細(xì)胞及離子通道的效應(yīng)來(lái)明確槐果堿的電生理性質(zhì)并探索其抗心律失常功能的機(jī)制。本文中所有涉及到的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合本院動(dòng)物福利，并獲得動(dòng)物使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 溶液配制

用于灌注的臺(tái)式液（Tyrodes）溶液的配方如下（mM）：NaCl：138；KCl：5.4；CaCl2：1.8；MgCl2：1；glucose：10；HEPES：10；pH：7.4。用于全部細(xì)胞Na+電流記錄的電極液配方如下（mM）：KCl：120；CaCl2：0.1；MgCl2：2；EGTA：1.1；HEPES：10；pH：7.2。水浴溶液采用上述Tyrodes液。用于內(nèi)向外Na+通道電流記錄的水浴溶液配方如下（mM）：KCl：120；CaCl2：0.1；MgCl2：2；EGTA：1.1；HEPES：10；pH：7.4。電極液配方如下（mM）：NaCl：180；KCl：1.3；CaCl2：1.5；MgCl2：0.5；glucose：5；HEPES：5；CoCl2：3；TEA：10；4-AP：10；CsCl：10；pH：7.2。用于穿孔膜片鉗電極液的配方如下（mM）：K-aspartate：130；MgCl2：2；CaCl2：5；EGTA：1.1；Na-HEPES：10；Na2-ATP：2；pH：7.2。實(shí)驗(yàn)中兩性霉素的使用濃度為240 μM。

槐果堿來(lái)自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院?；惫麎A注射液購(gòu)自于上海禾珈藥業(yè)公司，注射液濃度為10 g/L。Chromanol 293B購(gòu)自德國(guó)Aventis Pharma公司，采用DMSO溶解至濃度為10 mmol/L。多菲力特（dofetilide）購(gòu)自于英國(guó)EGIS藥物公司。

1.2 離體豚鼠心臟心電圖測(cè)試

采用體重為250～300 g的豚鼠（雌雄各半）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（浙）2012-0178]，將豚鼠采用腹腔注射5 mL/kg的20%的烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。將心臟快速取出后采用Langendorff灌注設(shè)備在80 cm水柱壓力下進(jìn)行記錄。Tyrodes液的溫度維持在37°C。將三個(gè)鉑電極分別置于心尖、右心房及主動(dòng)脈根部位用于心電圖的記錄。采用裝有PowerLab system軟件的電腦進(jìn)行信號(hào)的記錄。

1.3 新生大鼠心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)

根據(jù)之前文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)容進(jìn)行[15，16]，采用1日齡的新生大鼠（雌雄各半）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠采用腹腔注射5 mL/kg的20%的烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。將心臟取出后，將心室切成小塊后，采用含膠原酶的溶液進(jìn)行消化。離心兩次后從細(xì)胞懸液中獲得心肌細(xì)胞，將離體的心室肌細(xì)胞接種到含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的玻璃蓋玻片上生長(zhǎng)5～6 d。

1.4 豚鼠乳頭狀肌及家兔竇結(jié)節(jié)的制備

采用體重為250～300 g的豚鼠（雌雄各半）及體重為1.5～2.5 kg的家兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物采用靜脈注射濃度為30 mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉后，通過(guò)靜脈放血進(jìn)行處死。將心臟快速取出后迅速放入充滿Tyroses液的分離槽。將右心室乳頭狀肌肉或含部分左心室的竇結(jié)節(jié)切碎并以不銹鋼鋼針固定于灌流槽底部。灌流槽維持在37°C情況下，采用3 mL/min的Tyroses液進(jìn)行灌流。

1.5 快反應(yīng)及慢反應(yīng)動(dòng)作電位記錄

采用雙鉑電極對(duì)乳頭狀肌肉及竇房結(jié)分別采用頻率為1.1 Hz及2.2 Hz的矩形電流脈沖進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。每次脈沖的持續(xù)時(shí)間為0.1 ms，強(qiáng)度為閾值的1.5 倍。在刺激30 min后，跨膜動(dòng)作電位采用浸沒(méi)于3M KCl溶液的常規(guī)玻璃微電極（其中電極頭部電阻為15～20 MΩ）。通過(guò)裝配放大器及PowerLab界面軟件的電腦進(jìn)行采用和存儲(chǔ)。快反應(yīng)動(dòng)作電位的計(jì)算參數(shù)包括靜息電位（resting potential，RP）、動(dòng)作電位幅度（amplitude of action potential，APA）、最大去極化速率（Vmax）、動(dòng)作電位時(shí)程（action potential duration，APD）及有效不應(yīng)期。為了檢測(cè)有效不應(yīng)期，將豚鼠制備物采用頻率為1 Hz的系列脈沖連續(xù)刺激8次。在最后一次脈沖后，加入1次其他測(cè)試脈沖。通過(guò)調(diào)節(jié)8次脈沖及測(cè)試刺激的時(shí)間間隔，能夠用以誘導(dǎo)的額外動(dòng)作電位，最短的時(shí)間間隔被記錄為有效不應(yīng)期。

1.6 膜片鉗實(shí)驗(yàn)

采用膜片鉗技術(shù)來(lái)記錄全細(xì)胞及單通道電流。細(xì)胞采用之前提及Tyrodes液進(jìn)行灌注，流速為3 mL/min。采用穿孔膜片鉗技術(shù)進(jìn)行全細(xì)胞鈣流記錄，其優(yōu)點(diǎn)在于能夠阻斷鈣電流的衰減。灌注液中的4-AP能夠用于阻斷瞬時(shí)外向電流（Ito）顯示鈣離子電流。采用示波器及Axopatch-1D放大器來(lái)監(jiān)視和記錄鉗制電壓和通道電流。采用Clampex 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，通過(guò)Digidata1320進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。采樣速率為100 kHz、濾過(guò)頻率為10 kHz。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。連續(xù)性計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組和多組數(shù)據(jù)比較分別采用t檢驗(yàn)及方差分析進(jìn)行檢測(cè)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐果堿抗心律失常作用研究結(jié)果

在心動(dòng)過(guò)速的模型中，將心臟首先采用含15 μmol/L異丙腎上腺素Tyroses液進(jìn)行灌注6～8 min。隨后，當(dāng)心動(dòng)過(guò)速及室顫開(kāi)始出現(xiàn)后立即進(jìn)行記錄。隨后將槐果堿加入到上述灌注液中。11～17 min后，心動(dòng)過(guò)速或室顫現(xiàn)象消失，心電圖提示出現(xiàn)正常心跳。本實(shí)驗(yàn)共重復(fù)6次。全部豚鼠均在異丙腎上腺素誘導(dǎo)后出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)速，而槐果堿加入能夠抑制心動(dòng)過(guò)速。異丙腎上腺素能夠?qū)⑿穆蕪模?75±23）次/min增加到（218±26）次/min，從而引起心動(dòng)過(guò)速的出現(xiàn)，而槐果堿能夠?qū)⑿穆驶謴?fù)到（179±24）次/min并最終使心動(dòng)過(guò)速停止。將槐果堿洗去后能夠?qū)⑿穆驶謴?fù)到（207±28）次/min。

2.2 槐果堿對(duì)心室細(xì)胞快反應(yīng)動(dòng)作電位的效應(yīng)

在豚鼠乳頭狀肌的動(dòng)作電位穩(wěn)定后，采用含不同濃度槐果堿的Tyroses液進(jìn)行灌注。每次灌注持續(xù)的時(shí)間約8～10 min，同時(shí)檢測(cè)RP、APA、Vmax及APD。通過(guò)加到動(dòng)作電位不同去極化期額外的上限閾值的刺激來(lái)確定有效不應(yīng)期。當(dāng)通過(guò)槐果堿延長(zhǎng)APD及動(dòng)作電位的有效不應(yīng)期時(shí)，APA出現(xiàn)下降（表1）。為了檢測(cè)APD與槐果堿之間的劑量效應(yīng)，槐果堿的使用濃度范圍為1～100 μmol/L。使APD90延長(zhǎng)的EC50為5.93 μmol/L。

2.3 槐果堿對(duì)兔竇房結(jié)慢反應(yīng)動(dòng)作電位的效應(yīng)

為了明確槐果堿對(duì)竇房結(jié)的慢反應(yīng)動(dòng)作電位，將兔竇房結(jié)采用速率為130 次/min的電極刺激進(jìn)行處理。采用玻璃電極對(duì)刺激后的動(dòng)作電位進(jìn)行記錄[17]?；惫麎A誘導(dǎo)動(dòng)作電位參數(shù)的變化見(jiàn)表2及表3。當(dāng)采用不同濃度槐果堿處理后，APA及Vmax均出現(xiàn)下降。此外，APD90能夠通過(guò)槐果堿進(jìn)行延長(zhǎng)，與快反應(yīng)動(dòng)作電位的記錄結(jié)果一致。

2.4 槐果堿延長(zhǎng)APD的可能機(jī)制研究結(jié)果

通過(guò)chromanol 293B來(lái)特異性阻斷Iks，dofetilide阻斷Ikr。在實(shí)驗(yàn)中，先將chromanol 293B用于阻斷Iks，隨后采用不同濃度的槐果堿加入到灌注液中。結(jié)果顯示由chromanol 293B誘導(dǎo)的APD延長(zhǎng)能夠由槐果堿進(jìn)一步延長(zhǎng)，該結(jié)果提示槐果堿能夠通過(guò)抑制Ikr來(lái)增加APD。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，本文進(jìn)一步采用dofetilide來(lái)阻斷Ikr，從而實(shí)現(xiàn)APD的增加，隨后將不同濃度的槐果堿加入到灌注液中。槐果堿對(duì)APD的效應(yīng)在dofetilide處理的情況下消失。結(jié)果提示槐果堿通過(guò)阻斷Ikr而非Iks來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)APD的延長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

2.5 槐果堿對(duì)心肌細(xì)胞INa的調(diào)節(jié)作用

采用酶分離消化的新生大鼠心室細(xì)胞對(duì)細(xì)胞電流進(jìn)行記錄，將細(xì)胞從控制電位（-110 mV）向靜息電位（-50 mV）進(jìn)行去極化，時(shí)長(zhǎng)為300 ms。通過(guò)去極化過(guò)程誘導(dǎo)較大內(nèi)向電流，該電流被視作INa[18]。當(dāng)細(xì)胞采用10 μmol/L槐果堿灌注后內(nèi)向電流減少。結(jié)果顯示10 μmol/L槐果堿能夠?qū)е翴Na下降約18%。

2.6 槐果堿能夠?qū)π募〖?xì)胞ICaL的調(diào)節(jié)作用

通過(guò)穿孔鉗采用全部細(xì)胞進(jìn)行記錄。首先將新生大鼠心室細(xì)胞在-40 mV條件下將Na+離子通道失活，隨后將細(xì)胞去極化到20 mV指令電位，時(shí)長(zhǎng)為500 ms。由于4-AP用于阻斷Ito，內(nèi)向電流能夠在指令電位時(shí)進(jìn)行辨識(shí)。隨后將10 μmol/L槐果堿加入到灌注液中。3 min后，內(nèi)向電流出現(xiàn)減少，尾部電流（外向K+電流）也出現(xiàn)消失。相比于對(duì)照組，ICaL在20 mV指令電位時(shí)，平均減少（33.2±11.7）%。

3 討論

在本研究中，通過(guò)研究槐果堿對(duì)心臟、心肌細(xì)胞及離子通道的效應(yīng)來(lái)明確槐果堿的電生理性質(zhì)并探索其抗心律失常功能的機(jī)制。本文結(jié)果顯示異丙腎上腺素（15 μmol）引起的心律失常能夠通過(guò)槐果堿（300 μmol）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。槐果堿能夠降低4.0%的振幅，24.4%的快速應(yīng)答動(dòng)作電位最大去極化動(dòng)作電流及18.8%的Na離子電流，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期為21.1%。

0期快反應(yīng)動(dòng)作電位由快速內(nèi)向Na+電流進(jìn)行啟動(dòng)。本文實(shí)驗(yàn)證實(shí)槐果堿能夠抑制INa，這就能夠解釋為何槐果堿能夠在快反應(yīng)動(dòng)作電位時(shí)將APA和Vmax進(jìn)行降低。在內(nèi)向外記錄實(shí)驗(yàn)中，K+和Ca2+通道能夠通過(guò)CoCl2、TEA、4-AP及CsCl進(jìn)行阻斷；因此，本實(shí)驗(yàn)中獲得的內(nèi)向電流為Na+電流。槐果堿處理能夠降低Na+通道電流的開(kāi)放及大小，該結(jié)果提示槐果堿對(duì)Na+通道具有抑制效應(yīng)。

槐果堿能夠在全體細(xì)胞水平上降低慢內(nèi)向電流，即ICaL。慢ICaL能夠啟動(dòng)慢反應(yīng)動(dòng)作電位（包括竇房結(jié)中的動(dòng)作電位）。慢反應(yīng)動(dòng)作電位APA及Vmax依賴(lài)于Ca2+離子通道的動(dòng)態(tài)變化情況?；惫麎A能夠引起APA及Vmax，從而引起槐果堿對(duì)Ca2+離子通道的抑制效應(yīng)。

APD被認(rèn)為主要與內(nèi)向ICaL及外向的K+電流相關(guān)。本文結(jié)果顯示槐果堿能夠在快反應(yīng)動(dòng)作電位及慢反應(yīng)動(dòng)作電位的情況下延長(zhǎng)APD，該結(jié)果提示槐果堿能夠抑制外向的K+電流，該電流可能導(dǎo)致APD再次極化及延長(zhǎng)?；惫麎A介導(dǎo)的K+電流抑制可見(jiàn)于槐果堿介導(dǎo)的K+尾流減少。有必要指出的是，當(dāng)采用chromanol 293B來(lái)阻斷Iks，槐果堿能夠以劑量依賴(lài)的方式延長(zhǎng)APD；然而，當(dāng)通過(guò)dofetilide阻斷Ikr，槐果堿無(wú)法延長(zhǎng)APD。雖然該結(jié)果并不能排除是否Ikr能夠參與到該過(guò)程中，但本研究結(jié)果與之前Yang等[19]在其關(guān)于槐果堿對(duì)表達(dá)HERG通道的293細(xì)胞的效應(yīng)一致，其結(jié)果證實(shí)槐果堿能夠通常影響失活態(tài)來(lái)抑制HERG通道[19]。

槐果堿對(duì)L-型鈣電流具有降低效應(yīng)，而L-型鈣電流被認(rèn)為能夠縮短APD90并干擾槐果堿對(duì)APD的延長(zhǎng)效應(yīng)[20]，目前的研究認(rèn)為胞漿鈣離子濃度升高激活能夠促發(fā)兩種不同的再次極化電流。IkCa作為其中一種，為鉀離子Kv家族成員；而另一種Ito2則可能為鈣激活氯離子通道。這兩種電流均能夠?qū)Π麧{鈣離子濃度升高進(jìn)行應(yīng)答，其機(jī)制為縮短動(dòng)作電位時(shí)程，限制鈣流進(jìn)一步流入心臟?；诖耍狙芯空J(rèn)為槐果堿對(duì)IkCa效應(yīng)較小，其更傾向于延長(zhǎng)APD。

本文也存在一些不足之處，槐果堿對(duì)異丙腎上腺素引起的心動(dòng)過(guò)速具有明顯的抑制效應(yīng)，但仍不明確其電生理特性是否在其中發(fā)揮作用。異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心動(dòng)過(guò)速的機(jī)制較為復(fù)雜。有關(guān)是通過(guò)去極化后延遲還是通過(guò)再進(jìn)入機(jī)制還是通過(guò)改變心律仍不明確，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，本文結(jié)果證實(shí)槐果堿能夠逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素引起的心律失常，其作用機(jī)制為抑制Na離子、鈣離子及鉀離子電流。

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（收稿日期：2017-10-16）