楊凡 蔡毓新 賈文華 甄熙 唐艷領(lǐng) 史宣杰

摘 要： 根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）是一類嚴(yán)重危害經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物并廣泛分布于世界各地的重要的植物病原線蟲(chóng)。淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能夠寄生于根結(jié)線蟲(chóng)和孢囊線蟲(chóng)卵，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)有很強(qiáng)的抑制作用。為了檢驗(yàn)淡紫紫孢菌對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)的防治作用，測(cè)定了淡紫紫孢菌pt361對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生率、幼蟲(chóng)致死率，并分析了淡紫紫孢菌的代謝產(chǎn)物白灰制菌素，同時(shí)測(cè)定了其在土壤中的存活狀態(tài)。結(jié)果表明，淡紫紫孢菌pt361菌株對(duì)線蟲(chóng)卵寄生率為72.6%。其菌株混合發(fā)酵液對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率達(dá)95.2%。對(duì)pt361菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有白灰制菌素A和B，其濃度分別為98.9%和71.2%，這可能與淡紫紫孢菌防治根結(jié)線蟲(chóng)的機(jī)制有關(guān)。綜上所述，淡紫紫孢菌能有效防治黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)。

關(guān)鍵詞： 黃瓜； 淡紫紫孢菌； 根結(jié)線蟲(chóng)； 白灰制菌素

Abstract： Root knot nematode is a kind of important plant disease nematode， which distributes widely and causes serious harm to crop production in the world. The Purpureocillium lilacinum can inhibit root knot nematode according to parasitic on the root knot nematodes and sporangium. In order to investigate the preventive effect of Purpureocillium lilacinum on cucumber root knot nematode， the parasitic rate and larvae of mortality when the Purpureocillium lilacinum pt361 interacted with the cucumber root knot nematodes were measured， the metabolites of leucinostatins was analyzed， and the survival state of pt361 strains in soil was determined. The results showed that the parasitism rate of pt361 strains on cucumber root knot nematodes was 72.6%， and the larva fatality rate of its mixed fermentation broth could reach 95.2% on the cucumber rootworm. It was found that the concentrations of leucinostatins A and B were respectively 98.9% and 71.2% when the metabolites of pt361 strains were detected， which might be related to the prevention mechanism to control the root knot nematodes. In conclusion， the Purpureocillium lilacinum could effectively control the root nematode of cucumber.

Key words： Cucumber； Purpureocillium lilacinum； Root knot nematode； Leucinostatins

根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）是一種較為嚴(yán)重的土傳病害，全世界由根結(jié)線蟲(chóng)造成的農(nóng)作物損失高達(dá)10億美元[1-2]。黃瓜是最易受到根結(jié)線蟲(chóng)侵染的作物之一，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)30%～40%，甚至絕收[3]。生產(chǎn)上防治根結(jié)線蟲(chóng)主要有使用化學(xué)殺線劑、利用抗病品種以及生物防治等方式。化學(xué)防治雖然見(jiàn)效快，但有高毒性，污染環(huán)境。培育抗根結(jié)線蟲(chóng)作物被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)、安全、高效的方法，目前在番茄上的抗根結(jié)線蟲(chóng)基因Mi 1.2已被商業(yè)化生產(chǎn)[4]，但在黃瓜上的抗根結(jié)線蟲(chóng)基因尚未被發(fā)現(xiàn)[5-6]。生物防治根結(jié)線蟲(chóng)日益受到重視，是未來(lái)的趨勢(shì)之一。目前生物防治黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)的方法主要集中在線蟲(chóng)天敵和殺線蟲(chóng)植物提取液的研究上[7]，常見(jiàn)的有食線蟲(chóng)真菌包括寡孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）、淡紫紫孢菌（Paecilomyces lilacinus）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等寄生細(xì)菌以及放線菌中的一些種類。選擇合適的生防菌株防治黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義[8]。

淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能夠有效防治根結(jié)線蟲(chóng)、穿孔線蟲(chóng)、胞囊線蟲(chóng)、腎形線蟲(chóng)等，是一種極具推廣潛力的防治根結(jié)線蟲(chóng)的習(xí)居菌和功能菌[9-10]。淡紫紫孢菌能破壞根結(jié)線蟲(chóng)的蟲(chóng)卵結(jié)構(gòu)，同化蟲(chóng)卵物質(zhì)，使線蟲(chóng)不能正常孵化。筆者在對(duì)淡紫紫孢菌致病力研究時(shí)，篩選出了一株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)有致病力菌株pt361。筆者測(cè)定了淡紫紫孢菌pt361對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生率以及對(duì)線蟲(chóng)的致死力，并在菌株pt361的發(fā)酵液中檢測(cè)出了白灰制菌素A和B，其是白灰制菌素家族的重要組成成分，白灰制菌素A對(duì)線蟲(chóng)有致死作用。同時(shí)對(duì)淡紫紫孢菌在土壤中的存活作了初步分析，以便為淡紫紫孢菌生防菌株的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)方法

淡紫紫孢菌pt361，原始菌株pl36-1 T-DNA插入突變獲得穩(wěn)定的突變子。28 ℃ PDA平板培養(yǎng)，4 ℃試管保存。

1.2 培養(yǎng)基配方

PDA培養(yǎng)基：土豆提取液200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，高溫滅菌30 min。

PDB培養(yǎng)基：土豆200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL。

WA培養(yǎng)基：水1 000 mL，瓊脂18 g。

培養(yǎng)基B：50.0 g葡萄糖，5.0 g蛋白胨，5 g酵母提取物，1.0 g K2HPO4，10.0 g Na2CO3，0.2 g MgSO4·7H2O，加水定容至1 000 mL滅菌。

土壤分離培養(yǎng)基OHIO-agar：5 g葡萄糖，2 g酵母提取物，1 g NaNO3，0.5 g MgSO4·7 H2O，1 g KH2PO4，1 g牛膽粉，1 g丙酸鈉，18 g瓊脂，1 000 mL水。培養(yǎng)基中加入多菌靈，使培養(yǎng)基中藥劑最終質(zhì)量濃度為30.0 μg·mL-1。

1.3 淡紫紫孢菌pt361對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生率測(cè)定

2017年3月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室用1%次氯酸鈉溶液將黃瓜植株有根結(jié)線蟲(chóng)病害的病根浸泡并震蕩4 min，清洗并過(guò)篩后收集根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵。處理組將淡紫紫孢菌pt361培養(yǎng)3 d后，將線蟲(chóng)卵至于菌絲上方，每皿100個(gè)線蟲(chóng)卵，3個(gè)皿1重復(fù)，共3次重復(fù)。28 ℃溫箱黑暗培養(yǎng)9 d。對(duì)照線蟲(chóng)蟲(chóng)卵不作任何處理。之后用乳酸甘油溶液處理2 min，會(huì)發(fā)現(xiàn)透明的卵是被淡紫紫孢菌寄生的，未被寄生的卵仍為深色。寄生率/%=被寄生的卵的數(shù)量/總調(diào)查卵的數(shù)量。

1.4 淡紫紫孢菌pt361對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率測(cè)定

配置淡紫紫孢菌無(wú)菌發(fā)酵液0.5 mL；將從黃瓜根結(jié)上面分離到的線蟲(chóng)制成0.5 mL的線蟲(chóng)液（100條·mL-1），然后將二者混合均勻并置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)照組的線蟲(chóng)液加入等量的清水處理。每個(gè)處理3次重復(fù)。24 h后計(jì)算幼蟲(chóng)死亡率。死亡率=（Ca-Ta）/Ca，Ca代表對(duì)照中未死亡的線蟲(chóng)數(shù)量，Ta代表處理中未死亡的線蟲(chóng)數(shù)量。

1.5 淡紫紫孢菌pt361菌株代謝產(chǎn)物白灰制菌素的提取及測(cè)定

白灰制菌素提取方法如下[11]：將培養(yǎng)9 d的pt361菌株制成106孢子·mL-1孢子懸浮液，取1 mL放入100 mL培養(yǎng)基B的錐形瓶中28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)15 d。將1 mol·L-1 HCl溶液也加入到錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值到3.0，然后加入同體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液用5% NaHCO3溶液，將萃取液洗滌2次，真空旋轉(zhuǎn)干燥。然后用10 mL的甲醇溶液對(duì)粗提物即白灰制菌素進(jìn)行溶解，再用質(zhì)譜儀（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry MALDI-TOF MS）進(jìn)行物質(zhì)分析和濃度測(cè)定。

1.6 淡紫紫孢菌pt361菌株在土壤中的存活測(cè)定

將淡紫紫孢菌pt361菌株制成孢子液和固體發(fā)酵物2種形式，然后拌入土壤，使淡紫紫孢菌的濃度為106個(gè)·g-1。再將其裝入塑料杯（直徑7 cm，深8 cm）中，每杯裝土壤（黃壤土）基質(zhì)（V土︰V沙=1︰1）200 g，然后將其埋于田間土壤中（河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地）。每間隔10 d取出塑料杯，測(cè)定淡紫紫孢菌pt361在土壤中的定殖量，持續(xù)測(cè)定60 d。測(cè)定時(shí)間自2017年5—7月。設(shè)未接種做對(duì)照。

1.7 檢測(cè)方法

將塑料杯中的土壤混勻后分別稱取10 g 2份，一份放入烘箱中80 ℃12 h測(cè)質(zhì)量；一份用于分離淡紫紫孢菌。每次取3杯即為3次重復(fù)。將菌液均勻涂于平板上，放入恒溫箱中，28 ℃培養(yǎng)5 d后，計(jì)數(shù)平板菌落。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 12.0.1，數(shù)據(jù)表示平均值±SD標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。用Duncan's Multiple測(cè)試進(jìn)行多組分比較，確定組間差異顯著。P<0.05被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡紫紫孢菌pt361對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵寄生率的測(cè)定

淡紫紫孢菌pt361對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵的寄生率測(cè)定結(jié)果表明pt361菌株對(duì)線蟲(chóng)卵寄生率為72.6%。具體結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

2.2 淡紫紫孢菌pt361對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率的測(cè)定

淡紫紫孢菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率測(cè)定表明，菌株混合發(fā)酵液對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率達(dá)95.2%；pt361菌株對(duì)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率為3.6%。說(shuō)明淡紫紫孢菌代謝產(chǎn)物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)有強(qiáng)致死作用（表2）。

2.3 淡紫紫孢菌pt361中白灰制菌素的測(cè)定

通過(guò)提取淡紫紫孢菌pt361白灰制菌素發(fā)現(xiàn)，原始菌株pt361中白灰制菌素A和B以一定的比例存在，可以用來(lái)作為檢測(cè)線蟲(chóng)活性的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)測(cè)得白灰制菌素A和B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.9%和71.2%（表3）。

2.4 淡紫紫孢菌pt361菌株在土壤中的存活動(dòng)態(tài)

分別以固體發(fā)酵物和孢子液2種形式將pt361菌株施入土壤中，從圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)菌株的定殖量有所降低。固體發(fā)酵物總體比孢子液的存活量高，60 d后2種形式的菌株存活量還保持在105、104數(shù)量級(jí)，因此，固體發(fā)酵物更有利于pt361菌株在土壤中的長(zhǎng)期存活。

3 討論與結(jié)論

綜合開(kāi)發(fā)能防治根結(jié)線蟲(chóng)的菌劑是未來(lái)的研究熱點(diǎn)之一，已報(bào)道的叢枝菌根真菌能夠?qū)ξ鞴霞藿用缈鼓戏礁Y(jié)線蟲(chóng)，提高西瓜的生長(zhǎng)指標(biāo)和生理特性[12]，其也能與黃瓜建立共生體，防御黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)[13]；芽孢桿菌發(fā)酵的上清液處理黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)時(shí)，也能收到較好的效果[14]。淡紫紫孢菌是一種分布廣泛的線蟲(chóng)卵寄生真菌[15]，是植物寄生線蟲(chóng)的重要天敵，在殺線蟲(chóng)時(shí)具有安全、高效、持效時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，其對(duì)線蟲(chóng)的最重要的作用機(jī)制是寄生卵，寄生后使線蟲(chóng)卵殼發(fā)生了一系列的化學(xué)變化，最終影響線蟲(chóng)的正常發(fā)育而導(dǎo)致死亡[16]。

pt361菌株對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)寄生率的研究結(jié)果表明，pt361菌株可以侵染根結(jié)線蟲(chóng)的卵，寄生率達(dá)到72.6%；pt361菌株混合發(fā)酵液對(duì)線蟲(chóng)的致死率達(dá)到95.2%，在試驗(yàn)條件下，能有效防治根結(jié)線蟲(chóng)。為了最大限度發(fā)揮淡紫紫孢菌的抗線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)制定了2種形式的菌劑-固體發(fā)酵物和孢子液，發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵物能顯著提高pt361菌株在土壤中的存活率，可能是這種形式能給菌株提供固著的介質(zhì)，使淡紫紫孢菌能穩(wěn)定定殖在土壤中發(fā)揮生防效力。試驗(yàn)結(jié)果也表明，淡紫紫孢菌pt361以固體發(fā)酵物可以在土壤中存活60 d以上，且能一直維持較高的定殖量，這有利于淡紫紫孢菌在整個(gè)作物的生育期持續(xù)的防治土傳病害。

進(jìn)一步對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)酵液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了白灰制菌素A和B，白灰制菌素A在致死幼蟲(chóng)方面有重要的作用，可以作為檢測(cè)線蟲(chóng)的重要指標(biāo)，可望在將來(lái)更深層了解淡紫紫孢菌對(duì)線蟲(chóng)的致病機(jī)理及利用這一特點(diǎn)開(kāi)發(fā)新的復(fù)合制劑用于防控根結(jié)線蟲(chóng)，有利于淡紫紫孢菌在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用[17]。

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