王雨雪 劉夢(mèng)齡 王辛 肖強(qiáng)

摘要：探討刺桐（Erythrina variegata Linn.）葉片過(guò)氧化物酶在清除水體中EDCs的應(yīng)用前景，對(duì)刺桐葉過(guò)氧化物酶與H2O2形成的催化體系降解聯(lián)苯胺的效果和反應(yīng)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，刺桐過(guò)氧化物酶生物催化體系對(duì)聯(lián)苯胺有良好的降解效果。在溫度25～45 ℃，pH 7～8，H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為3.0～5.0條件下，10 U/mL刺桐過(guò)氧化物酶濃度對(duì)200 μmol/L聯(lián)苯胺的3 h降解率達(dá)100%，效果最佳。

關(guān)鍵詞：刺桐（Erythrina variegata Linn.）；過(guò)氧化物酶；聯(lián)苯胺；降解

中圖分類(lèi)號(hào)：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）14-0042-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.009 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to develop economic value of the leaves，investigated the application prospect of the peroxidase in the Erythrina variegatas leaves in the removal of EDCs in water. The effect and best reaction conditions for the degradation of benzidine by E. variegata peroxidase-H2O2 were studied. The results showed that the E. variegata peroxidase-H2O2 had degradation effects on benzidine. Respectively，suitable reaction conditions： Temperature of 25～45 ℃， pH 7～8，H2O2/BZ=3.0～5.0（benzidine and hydrogen peroxide molar ratio），when the concentration of peroxidase was 10 U/mL，the best scavenging rate to benzidine （200 μmol/L） was 100%.

Key words： Erythrina variegata Linn.； peroxidase； benzidine； degradation

聯(lián)苯胺類(lèi)化合物被廣泛用于印染、紡織、皮革等行業(yè)。該類(lèi)化合物具有較高的毒性，在芳胺化合物中，聯(lián)苯胺（Benzidine，BZ）的致癌性僅次于2-萘胺[1]，長(zhǎng)期接觸聯(lián)苯胺可增加罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]，尤其是職業(yè)接觸[3]。目前聯(lián)苯胺廢水的處理方法有電解法、化學(xué)催化氧化法、微生物降解法、光催化法。電極催化法耗電量大、工序復(fù)雜[4]、經(jīng)濟(jì)效益低。利用熱活化過(guò)硫酸鹽可以降解廢水中的聯(lián)苯胺[5]。微生物降解法綠色無(wú)污染[6]，但周期長(zhǎng)，在惡劣的污水環(huán)境中微生物生存能力會(huì)受到限制。光電催化法多利用光催化劑催化降解聯(lián)苯胺[7]，高效廉價(jià)，但降解率較低。過(guò)氧化物酶催化降解聯(lián)苯胺法是近年來(lái)新興的酚污染降解法，以其微量、高效、綠色經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)受到關(guān)注。

過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種以過(guò)氧化氫為電子受體[8]，通過(guò)催化底物發(fā)生氧化反應(yīng)改變結(jié)構(gòu)，引起底物理化性質(zhì)發(fā)生變化的生物催化劑。它廣泛分布于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，在細(xì)胞中發(fā)揮催化降解過(guò)氧化氫作用。過(guò)氧化物酶催化活性在工業(yè)上也用于石化、造紙、紡織等行業(yè)廢水中酚類(lèi)和芳香胺類(lèi)污染物高效降解[9]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)展了過(guò)氧化物酶用于醫(yī)療診斷、廢物脫色、胺類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)降解的條件優(yōu)化、動(dòng)力學(xué)特性和反應(yīng)機(jī)理研究[10]，最早采用過(guò)氧化物酶降解廢水中的酚類(lèi)和芳香胺類(lèi)化合物，并將其用于含酚廢水的脫色，該過(guò)氧化物酶對(duì)底物的氧化是高度非特異的[11]，這使得利用過(guò)氧化物酶結(jié)合過(guò)氧化氫催化氧化降解聯(lián)苯胺成為可能[12]。

刺桐（Erythrina variegata Linn.），多年生落葉喬木，具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值，在中國(guó)華南地區(qū)園林中被廣泛應(yīng)用[13]。在其生長(zhǎng)過(guò)程中，大量的刺桐葉片凋落，刺桐葉過(guò)氧化物酶具有較高活性、穩(wěn)定性較好。本研究通過(guò)提取刺桐中的過(guò)氧化物酶，構(gòu)建過(guò)氧化物酶-H2O2生物催化體系，利用控制單因素變量法研究刺桐過(guò)氧化物酶催化降解水環(huán)境中聯(lián)苯胺的最佳反應(yīng)條件，單因素變量包括過(guò)氧化物酶酶量、溫度、pH、H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比等。旨在充分利用刺桐，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，探索一種高效、經(jīng)濟(jì)、清潔的聯(lián)苯胺污染處理方法的工藝條件，以期為生物催化氧化法降解工業(yè)廢水中聯(lián)苯胺類(lèi)提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以湖北民族學(xué)院植物園內(nèi)種植的10年生刺桐（經(jīng)湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院易詠梅教授鑒定）成熟葉為原料。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備 采摘成熟無(wú)病蟲(chóng)害刺桐樹(shù)葉，去除主脈，剪碎，稱(chēng)取50 g，自來(lái)水洗凈后，用去離子水沖洗，再用吸水紙吸干表面水分。分次加入250 mL預(yù)凍的含5% PVP-K30（聚乙烯吡咯烷酮-K30）和2 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸）的冰水混合磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）勻漿，4 ℃下5 000 r/min離心，上清液即為粗酶液，置于4 ℃保存。

1.2.2 酶活的測(cè)定 參考Amako等[14]的方法并稍做改進(jìn)。

1）反應(yīng)混合液配制。取50 mL磷酸緩沖液于燒杯中，加入28 μL愈創(chuàng)木酚于恒溫式磁力攪拌器上加熱攪拌，直至完全溶解。待溶液冷卻后加入19 μL 30% H2O2溶液，攪拌混勻后置于4 ℃低溫保存。

2）酶活性測(cè)定。反應(yīng)體系共4.0 mL（1.9 mL 100 mmol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液，pH 6.0，含1 mL 40 mmol/L愈創(chuàng)木酚和1 mL 40 mmol/L H2O2，0.1 mL酶液），于波長(zhǎng)470 nm，30 ℃下記錄OD變化。1個(gè)酶單位定義為測(cè)定條件下每分鐘OD470 nm變化0.1所需的酶量。

1.2.3 酶活力計(jì)算 以每分鐘OD變化（升高）0.1個(gè)酶活性單位（U），按下式計(jì)算活性[15]。

其中，ΔA470 nm指反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W指取酶液總蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；t指反應(yīng)時(shí)間（min）；Vt指取酶液總體積（mL）；Vs指測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）。

1.2.4 聯(lián)苯胺降解條件 研究最佳酶濃度時(shí)，在0.05 mol/L pH為7的磷酸-檸檬酸緩沖液中，含200 μmol/L聯(lián)苯胺（后續(xù)試驗(yàn)均使用此濃度）、200 μmol/L過(guò)氧化氫，反應(yīng)溫度25 ℃（在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上操作），設(shè)置酶濃度分別為2、5、10 U/mL，之后對(duì)其他降解條件的研究除變量外均采用此條件。研究最佳溫度時(shí)，設(shè)置的反應(yīng)溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃。研究最佳pH時(shí)，采用0.05 mol/L緩沖液體系，pH 3～5采用乙酸緩沖液，pH 7～8采用磷酸鹽緩沖體系，pH 9采用硼酸鹽緩沖液。研究最佳H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比時(shí)，按照H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為0.2、0.5、0.8、1.2、2.0、3.0、5.0加入物質(zhì)的量溶液。反應(yīng)混合物置于恒溫水浴鍋中攪拌，加入物質(zhì)的量溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)體系共20 mL。于反應(yīng)0（未加物質(zhì)的量時(shí)）、1、3、5、15、45、90、120、180 min取1 mL反應(yīng)溶液，加入2 mL甲醇終止反應(yīng)，即實(shí)現(xiàn)刺桐葉片過(guò)氧化物酶對(duì)聯(lián)苯胺的降解。在終止反應(yīng)液里加入適量明礬，搖勻，過(guò)夜沉淀后，5 000 r/min離心10 min。上清液過(guò)0.22 μm濾膜后檢測(cè)聯(lián)苯胺含量。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜分析條件 聯(lián)苯胺濃度采用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[16]測(cè)定，采用Agilent公司ZORBAX C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱。流動(dòng)相為50%甲醇-水溶液，柱溫30 ℃，體積流量0.2 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜分析條件 ESI離子源負(fù)模式，干燥氣溫度350 ℃，流速10 L/min；霧化器壓力45 psig，毛細(xì)管電壓3 500 V，毛細(xì)管出口電壓150 V，錐孔電壓65 V，采集速度1.5 spectra/s，選擇離子（ESI）采集方式，選定的分子離子[M-H]-的質(zhì)荷比為184.2（聯(lián)苯胺）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳降解酶濃度確定

在pH 7的磷酸緩沖液中，含200 μmol/L聯(lián)苯胺，400 μmol/L H2O2，反應(yīng)溫度25 ℃，改變酶濃度（2～10 U/mL），考察不同酶濃度對(duì)降解聯(lián)苯胺的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 1。從圖1可以看出，隨著反應(yīng)體系酶濃度的升高，聯(lián)苯胺最終剩余率不斷下降，當(dāng)酶濃度達(dá)到10 U/mL時(shí)，3 h后可以完全降解聯(lián)苯胺，低于此濃度則不能完全降解，這主要由于酶濃度較低時(shí)單位體積反應(yīng)溶液中無(wú)法提供一定數(shù)量的活性中心，造成聯(lián)苯胺降解率降低。

2.2 最佳降解pH的確定

在緩沖液中，含200 μmol/L聯(lián)苯胺，400 μmol/L H2O2，10 U/mL過(guò)氧化物酶，溫度為25 ℃，用醋酸-醋酸鈉、磷酸-檸檬酸、硼砂緩沖液控制反應(yīng)體系pH（3～9），考察不同pH對(duì)刺桐葉片過(guò)氧化物酶降解聯(lián)苯胺的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 2。從圖2可以看出，在pH為8時(shí)，催化反應(yīng)經(jīng)過(guò)90 min對(duì)聯(lián)苯胺的降解率達(dá)到100%，pH為7時(shí)，3 h后對(duì)聯(lián)苯胺的降解率也能達(dá)到100%。在pH 3～8時(shí)，聯(lián)苯胺降解率有隨著pH的升高逐漸升高的趨勢(shì)，在pH 9條件下，聯(lián)苯胺不能被完全降解。

2.3 最佳降解溫度的確定

在pH 7的磷酸緩沖液中，含200 μmol/L聯(lián)苯胺，400 μmol/L H2O2，10 U/mL過(guò)氧化物酶，改變溫度（25～50 ℃），考察不同溫度對(duì)刺桐葉片過(guò)氧化物酶降解聯(lián)苯胺的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 3。從圖3可以看出，在溫度為25～45 ℃時(shí)，3 h后反應(yīng)體系中的聯(lián)苯胺均能被完全降解，且趨勢(shì)表現(xiàn)為隨著溫度的升高催化反應(yīng)速率逐漸減慢，在溫度為25 ℃條件下，催化反應(yīng)經(jīng)過(guò)90 min即可完全降解聯(lián)苯胺，溫度為50 ℃條件下，3 h后聯(lián)苯胺的降解率只有70%左右。

2.4 最佳降解H2O2濃度的確定

在pH 7的磷酸緩沖液中，含200 μmol/L聯(lián)苯胺，400 U/mL過(guò)氧化物酶，溫度為25 ℃，按照H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為0.2～5.0加入H2O2溶液，考察H2O2與聯(lián)苯胺不同摩爾比對(duì)刺桐葉片過(guò)氧化物酶降解聯(lián)苯胺的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，當(dāng)H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為3.0～5.0時(shí)均能達(dá)到100%的降解率。H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比在3.0～5.0以下時(shí)，3 h后聯(lián)苯胺的降解率和降解反應(yīng)速率隨著物質(zhì)的量濃度比的增大而增大。綜合上述分析，刺桐過(guò)氧化物酶-H2O2催化降解聯(lián)苯胺反應(yīng)體系優(yōu)化H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為3.0～5.0。

3 小結(jié)與討論

植物過(guò)氧化物酶催化降解酚類(lèi)有機(jī)物的實(shí)質(zhì)是氧化耦合反應(yīng)，能使帶有酚或者苯胺官能團(tuán)的化合物被氧化形成自由基或醌中間體，再通過(guò)共價(jià)鍵相互聚合，形成無(wú)定形的化合物[17，18]。目前關(guān)于不同植物過(guò)氧化物酶降解酚類(lèi)有機(jī)污染物已有許多報(bào)道。林玲云[19]利用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化氧化苯胺中間體乙醇胺（Monoethanolamine，MEA）的降解率可達(dá)到99%；Kurnik等[20]利用馬鈴薯過(guò)氧化物酶降解2，4-二氯苯酚的降解率達(dá)95%～98%；Ahmedi等[21]研究結(jié)果顯示，過(guò)氧化物酶對(duì)剛果紅（Congo red，CR）的催化降解率可達(dá)95%左右。以上結(jié)論均與本研究的最終降解率相接近。本研究中催化降解聯(lián)苯胺的酶濃度試驗(yàn)的結(jié)果表明，在10 U/mL的酶濃度下，刺桐葉過(guò)氧化物酶對(duì)水環(huán)境中200 μmol/L聯(lián)苯胺的3 h降解率可以達(dá)到100%，且反應(yīng)后的溶液中剩余酶活并未出現(xiàn)明顯下降，仍有利用價(jià)值。

不同植物來(lái)源過(guò)氧化物酶的性質(zhì)以及降解的對(duì)象不同導(dǎo)致降解反應(yīng)的最佳條件也不同。洪健等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在15～80 ℃，厚樸過(guò)氧化物酶活性隨著溫度的升高而升高，熱穩(wěn)定性較好，具有較寬的溫度適應(yīng)范圍。Kurnik等[23]發(fā)現(xiàn)，在10～60 ℃，馬鈴薯過(guò)氧化物酶對(duì)苯酚的降解率達(dá)97%。本研究中，刺桐過(guò)氧化物酶在25～45 ℃，可以保持催化降解聯(lián)苯胺的良好效果，即該酶能夠保持較好的溫度適宜性。在溫度為50 ℃時(shí)，該酶對(duì)聯(lián)苯胺的催化降解率顯著下降，說(shuō)明該催化反應(yīng)受溫度影響較大，該酶耐高溫性能較差。這可能是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致了酶的構(gòu)象發(fā)生改變，對(duì)酚類(lèi)化合物的降解率也不穩(wěn)定。而此反應(yīng)在室溫下進(jìn)行即可達(dá)到良好的效果，無(wú)需特別控制反應(yīng)溫度，這對(duì)其在工廠化應(yīng)用方面很有利。

有研究顯示，過(guò)氧化物酶在一個(gè)較寬的pH范圍內(nèi)都能保持較好的處理效果[24]，羅思強(qiáng)[25]研究過(guò)氧化物酶降解NP的pH優(yōu)化試驗(yàn)表明，過(guò)高或過(guò)低的pH都會(huì)導(dǎo)致酶的催化效率降低；聶艷艷等[26]研究表明，氯過(guò)氧化物酶催化降解鄰苯二胺的最佳pH為5，本研究中刺桐過(guò)氧化物酶降解聯(lián)苯胺的最佳pH為7、8，對(duì)聯(lián)苯胺的最終降解率均能達(dá)到100%，表明不同來(lái)源的過(guò)氧化物酶發(fā)揮作用的最佳pH不同。另一方面，在pH 3～7，pH越大，催化降解聯(lián)苯胺的反應(yīng)越迅速，降解率越高，這可能是由于pH的降低影響了底物和酶的解離程度，導(dǎo)致催化中間體的形成受阻，從而降低酶的活性，減慢了催化反應(yīng)的速率。當(dāng)pH為9時(shí)，聯(lián)苯胺也不能被完全降解，這可能是由于溶液中的OH-逐漸增加會(huì)抑制H2O2分解過(guò)程中·OH的產(chǎn)生[27]，降低了氧化劑的濃度，減慢了催化反應(yīng)速率并影響聯(lián)苯胺的最終降解率。

趙廣華等[28]研究不同濃度的H2O2催化降解雙酚A試驗(yàn)結(jié)果表明，催化反應(yīng)體系中H2O2與雙酚A最適物質(zhì)的量濃度比為5，在50 min內(nèi)可以完全清除。在本研究中，刺桐葉過(guò)氧化物酶反應(yīng)體系中H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為3.0～5.0時(shí)，可以完全清除，二者結(jié)果相近，其酶促降解反應(yīng)的作用趨勢(shì)是當(dāng)聯(lián)苯胺與H2O2摩爾比低于最適摩爾比時(shí)，酶對(duì)聯(lián)苯胺的催化降解率隨聯(lián)苯胺與H2O2摩爾比增加而增加，當(dāng)聯(lián)苯胺與H2O2摩爾比高于最適摩爾比時(shí)，酶對(duì)聯(lián)苯胺的催化降解率隨聯(lián)苯胺與H2O2摩爾比增加而降低。這可能是由過(guò)量的H2O2與有活性的酶中間物反應(yīng)形成失活態(tài)造成的，類(lèi)似于辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）失活機(jī)理[29]。

綜上所述，從刺桐葉片中提取到活性較高的過(guò)氧化物酶，該酶在pH 7～8，溫度25～45 ℃，H2O2與聯(lián)苯胺物質(zhì)的量濃度比為3.0～5.0條件下，對(duì)聯(lián)苯胺降解率可達(dá)100%，顯示了刺桐葉過(guò)氧化物酶應(yīng)用于酚類(lèi)污染治理的潛力。

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