李明慧，尚一娜，霍麒文，陳 境，張曉寧，邢葉妮，楊姝玉，王俊國*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌真空冷凍干燥是將乳酸菌細胞懸浮液凍結(jié)后，提高真空度使冰晶在低溫條件下升華變成凍干粉狀態(tài)的技術(shù)[1]。該方法主要是依據(jù)微生物的生理、生化特點，使菌株的代謝處于不活潑的狀態(tài)，生長和繁殖受到抑制，達到休眠的狀態(tài)，以保持菌株的原有特性[2]。真空冷凍干燥技術(shù)發(fā)明于20世紀(jì)60年代初期，現(xiàn)已在工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模使用。與其他保藏菌株的方法相比，經(jīng)過冷凍干燥技術(shù)處理后的菌株含活菌數(shù)量較高，發(fā)酵活力較好，遺傳特性較為穩(wěn)定，同時它在儲存和運輸?shù)确矫娉杀据^為低廉，因此冷凍干燥技術(shù)有助于菌體貯藏與應(yīng)用[3-4]。

但冷凍干燥也會導(dǎo)致乳酸菌菌體活力下降甚至死亡[5-6]。為了探究冷凍干燥導(dǎo)致乳酸菌發(fā)酵劑失活的機制，國內(nèi)外學(xué)者們進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后細菌的存活率以及發(fā)酵活力降低的主要原因有以下幾個方面：冷凍和干燥過程造成的細胞膜通透性增加、膜流動性降低、細胞酶及相關(guān)蛋白質(zhì)變性和核糖核酸結(jié)構(gòu)變化等[7-8]。

盡管大量研究證明冷凍干燥會對乳酸菌的發(fā)酵活力造成一定程度上的損傷，并提出了相應(yīng)的解決辦法，但沒有對其失活機制進行系統(tǒng)地分析，本文以細胞膜、酶、蛋白質(zhì)以及遺傳物質(zhì)等為主要對象，對真空冷凍干燥的損傷機制進行了詳細的總結(jié)，為制備冷凍干燥高效濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑提供一定的參考。

1 冷凍干燥對細胞膜通透性的影響

1.1 冷凍干燥對細胞膜通透性的作用方式

細胞膜可以使菌體與外部環(huán)境隔離，是保護乳酸菌的主要屏障，因此膜是否完整、是否受損是冷凍干燥過程中最受關(guān)注的焦點[9]。

在冷凍干燥過程中，有許多因素會影響膜的通透性，進而造成細胞膜的損傷。這主要與冷凍過程中冰晶的形成以及干燥過程中磷脂雙分子層的損傷有關(guān)。其中冰晶的形成有可能會導(dǎo)致細胞膜的機械損傷，這也是造成細胞死亡的主要原因。在冷凍干燥的預(yù)凍過程中，菌株內(nèi)的游離態(tài)水凍結(jié)后會形成冰晶，一般冰晶越大，細胞膜越容易破裂，細胞越容易死亡；冰晶越小，對細胞膜的機械損傷也較小[10]。同時在冷凍過程中溫度的波動也會使胞內(nèi)冰晶發(fā)生重結(jié)晶，使冰晶變大，破壞細胞膜。

如圖1所示，在凍結(jié)過程中，凍結(jié)速率的變化會導(dǎo)致細胞內(nèi)外水分含量的變化，細胞懸液以1 ℃/min的速率降溫至-20～-40 ℃，1 h左右達到凍結(jié)視為慢速凍結(jié)；而細胞懸液以10 ℃/min以上的速率降溫至-20～-40 ℃，短時間內(nèi)達到凍結(jié)視為快速凍結(jié)[11]。若冷凍速率較快，胞內(nèi)水分還來不及外滲就被凍成冰晶，會造成冰晶體積過大使細胞受到機械損傷，這種胞內(nèi)凍結(jié)形成的冰晶會對細胞產(chǎn)生傷害；若冷凍速率較慢，游離水在細胞外部形成冰晶，胞內(nèi)水分則會外滲到胞外，細胞外形成的冰晶本身或冰晶形成的過程會對細胞造成較大的傷害。冷卻速率的緩慢或快速是相對的，并且不同的菌株所需的凍結(jié)速率有所不同，因此針對不同菌株應(yīng)選用最適于該菌株的凍結(jié)速率。采用最適凍結(jié)速率進行冷凍時，雖然菌體細胞內(nèi)的水分會滲透到細胞外，但細胞體積收縮較小，結(jié)構(gòu)仍與原來相似，且降低了菌體細胞的發(fā)酵活性，因此對細胞產(chǎn)生的傷害遠遠小于大量水分在胞內(nèi)凍結(jié)所產(chǎn)生的傷害[12]。

圖 1 凍結(jié)速率對冰晶形成的影響[13]Fig. 1 Effect of freezing rate on crystal growth[13]

除此之外，冰晶對乳酸菌的影響還與菌體的形狀有關(guān)。通過對比相同條件下的球菌和桿菌的凍干存活率，發(fā)現(xiàn)菌體表面積越大的細胞存活率越低，而且細胞的表面積越大，在冷凍過程中形成的冰晶對膜的損傷越大[14]。

細胞膜中磷脂的極性端在一定程度上以水合形式存在，而且每個磷脂的極性端與其他磷脂分子的極性端被水分子隔開，當(dāng)磷脂干燥脫水時，以氫鍵相連的水分子從磷脂雙分子層的頭部基團移走，頭部位置出現(xiàn)空位，?；鶗娂拥筋^部空位上，鏈間范德華力增強，而且磷脂分子會由液晶相向凝膠相轉(zhuǎn)變；因此磷脂分子間可能出現(xiàn)空位，膜的滲透性加大，使細胞內(nèi)的酶泄漏及胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶出等，進而導(dǎo)致細胞活力下降，產(chǎn)酸性能降低[15]。Basholli-Salihu等[16]通過對比冷凍和冷凍干燥的菌體活性以及細胞膜內(nèi)外酶活力發(fā)現(xiàn)，菌體經(jīng)過冷凍干燥后其酶活力及發(fā)酵活力的下降程度均高于冷凍樣品，說明干燥過程中細胞失水造成的損傷會導(dǎo)致菌的活力進一步下降。

前人研究發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后保加利亞乳桿菌細胞膜的通透性出現(xiàn)損傷，細胞內(nèi)外離子發(fā)生轉(zhuǎn)移，細胞內(nèi)部的離子環(huán)境發(fā)生改變；因此可依據(jù)這種離子濃度的改變，評價細胞膜損傷的情況[1]。王飚等[17]通過特異性熒光探針法測定了冷凍干燥過程中細胞膜對H+和Ca2+的通透性變化，研究了乳酸菌細胞膜在冷凍干燥過程中完整性的變化；結(jié)果顯示，與凍干前相比，凍干后細胞內(nèi)pH值明顯下降，胞內(nèi)外pH值梯度遭到了破壞，細胞膜對H+的通透性增大；另外，冷凍干燥也會導(dǎo)致細胞外的鈣離子濃度增加，亦說明細胞膜的通透性增大。同時有研究還發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶活力的高低能反映細胞膜通透性的改變情況，通過測定細胞內(nèi)滲出胞外的β-半乳糖苷酶活力可判定細胞膜損傷的情況。經(jīng)研究，對比添加保護劑和未添加保護劑的胞外β-半乳糖苷酶活力，發(fā)現(xiàn)未添加保護劑的胞外β-半乳糖苷酶活力更大；說明冷凍干燥會造成細胞膜通透性增大，造成菌體發(fā)酵活力下降[18-19]。

1.2 減少細胞膜損傷所采取的措施

近年來有學(xué)者通過調(diào)整冷凍溫度和速率減小冰晶體積，從而減輕細胞膜損傷對菌體造成的不利影響。李寶磊[19]通過測定冷凍干燥后的Streptococcus thermophilus SP1.1發(fā)酵活力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過液氮（-196 ℃）冷凍處理后的菌體發(fā)酵活力變化最小；這是由于胞內(nèi)游離水在超高速冷凍速率下形成微晶體，減少了對細胞膜的損傷。所以選擇合適的預(yù)冷凍速率對菌體活力的提高也尤為重要。

以脫脂乳作為凍干保護劑可以穩(wěn)定細胞膜的結(jié)構(gòu)，減少或防止冷凍干燥對細胞的損傷，而且細胞在復(fù)水時也可防止膜受到?jīng)_擊。另外在脫脂乳中添加其他成分的復(fù)合保護劑可以成倍地增強對菌體的保護作用。曾小群等[20]采用脫脂乳復(fù)合保護劑，制備出Lactobacillus casei凍干存活率達98.74%的高活性酸奶發(fā)酵劑。增加Ca2+與吐溫-80的添加量，可以達到維持細胞膜流動性的作用，對菌體的凍干存活率有顯著提高作用[21]。添加甘油也可以保護細胞膜的完整性，因為甘油具有很強的親水性，能夠穩(wěn)定細胞膜的結(jié)構(gòu)，減少或防止細胞遭受干燥脫水的損傷，并且細胞在復(fù)水時也可防止膜結(jié)構(gòu)受到?jīng)_擊[22]。

2 冷凍干燥對細胞膜流動性的影響

2.1 冷凍干燥對細胞膜流動性的作用方式

細胞膜的流動性對于細胞的物質(zhì)運輸、細胞識別、細胞免疫、細胞分化與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)等都有著重要意義。低溫條件下，磷脂分子由于脂酰鏈的相互靠近產(chǎn)生疏水間力，使磷脂分子呈有序的剛性狀態(tài)，即凝膠態(tài)；隨著溫度的升高，脂酰鏈因布朗運動加強而排列疏松，脂雙層呈現(xiàn)相對無序狀態(tài)，即液晶態(tài)（圖2）。兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)變溫度稱為相變溫度，在冷凍干燥過程中，伴隨著水分含量的減少，磷脂分子會由液晶態(tài)向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變，造成磷脂分子流動性下降。膜的流動性受磷脂分子脂酰鏈飽和度和長度的影響，飽和度較高時脂鏈延展充分，更易借助范德華力相互靠近形成晶狀體列陣，同時脂酰鏈越長，越易通過疏水力相互聚合成穩(wěn)定的凝膠態(tài)，導(dǎo)致細胞膜流動性下降[23]。

圖 2 水分含量與相轉(zhuǎn)變關(guān)系圖[13]Fig. 2 Relationship between moisture content and phase transition[13]

細菌本身可以通過自我調(diào)節(jié)來克服細胞膜流動性下降對其造成的不良影響，主要有兩個途徑：增加膽固醇在生物膜中的比例以及調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例。膽固醇對生物膜的流動性具有雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)膜的流動性過高時，膽固醇的增加可以調(diào)節(jié)膜的流動性和通透性，從而使膜趨于晶膠態(tài)；當(dāng)膜的流動性過低時，膽固醇可以通過調(diào)節(jié)使磷脂分子排列更加有序，增強膜的流動性[24]。

在冷凍過程中，乳酸菌可以通過乳酸脫氫酶調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例。細胞膜脂肪酸成分是影響細胞抗冷凍性的重要指標(biāo)。脂肪酸的不飽和指數(shù)決定了細胞膜的黏度和厚度，高含量的不飽和脂肪酸可以提高細胞膜對凍干的抵抗力[4]。冷凍干燥后乳酸菌細胞膜上的飽和脂肪酸含量下降，而不飽和脂肪酸含量增加；這是由于在相對低的溫度下，細胞膜中乳酸脫氫酶的活力增加，使不飽和脂肪酸含量增加，膜的流動性增強，不飽和脂肪酸中順式雙鍵的存在阻止了脂肪酸分子間的整齊排列，這種排列會導(dǎo)致脂肪膜的流動性下降[25]。

盡管不飽和脂肪酸含量的增加在冷凍過程中可以提高細胞膜的抗冷凍能力，但這些不飽和脂肪酸在有氧條件下儲存過程中也易發(fā)生氧化。Hansen等[26]認(rèn)為細胞膜脂質(zhì)氧化會對細胞的生存機制造成很大影響。由于不飽和脂肪酸亞甲基上的氫原子較為活潑，易被自由基奪走，產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，與氧氣結(jié)合形成脂質(zhì)過氧自由基，不斷的循環(huán)造成脂質(zhì)鏈不斷延長，導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量的減少，降低細胞膜的流動性，影響細胞膜的結(jié)構(gòu)和正常生理功能；脂肪酸氧化產(chǎn)生的自由基對細胞膜的影響還體現(xiàn)在自由基引入親水基團后降低了磷脂雙分子層的疏水性，由于脂雙層的疏水端通過疏水力的作用相互聚攏，自動組裝成雙分子層，而疏水力的降低導(dǎo)致組裝脂雙層的驅(qū)動力降低，使脂雙層結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定；同時自由基引入的親水基團也會削弱磷脂雙層與內(nèi)在蛋白質(zhì)的疏水相互作用，由于細胞膜內(nèi)蛋白是通過非極性氨基酸殘基與膜脂分子的疏水作用而插入脂雙分子層中，因此疏水作用減弱使內(nèi)在蛋白（包括膜錨蛋白）的嵌入和移動受到影響，進而影響到細胞膜的功能，而且自由基也可以直接誘導(dǎo)DNA出現(xiàn)損傷。Kandil等[27]也認(rèn)為膜脂肪酸的氧化是造成微生物細胞在儲存過程中死亡最主要的原因。膜脂肪酸氧化的程度與細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸的比值有關(guān)[28]。

在冷凍干燥過程中，有些乳酸菌可以將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀脂肪酸。Velly等[29]認(rèn)為細胞膜中的環(huán)狀脂肪酸有助于提高菌株的抗凍能力。在冷凍過程中，菌體以不飽和脂肪酸（棕櫚油酸、異油酸和油酸等）為底物快速合成環(huán)式脂肪酸，這個過程是通過對不飽和脂肪酸的一個順式雙鍵進行環(huán)丙烷化修飾來實現(xiàn)的。Munoz-Rojas等[30]認(rèn)為細胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸含量的增加可以提高菌體細胞膜的流動性。而且環(huán)丙烷脂肪酸的化學(xué)性能穩(wěn)定，一旦形成，就會起到穩(wěn)定細胞膜組成成分的作用；環(huán)丙烷脂肪酸的抗氧化能力較強，化學(xué)反應(yīng)活性較低[31]。因此，可以推測細胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸的積累對菌體提高抗冷脅迫能力可能具有積極的作用。

2.2 改善細胞膜流動性的方法

研究發(fā)現(xiàn)可以通過改變培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件改善細胞膜的流動性。人們發(fā)現(xiàn)在低酸環(huán)境下生長的乳酸菌，在冷凍干燥時細胞膜的流動性保持的更好。Wang Yu等[32]發(fā)現(xiàn)，低pH值條件可以有效改善膜的流動性，使得保加利亞乳桿菌能夠更有效地抵抗冷凍傷害。Palmfeldt等[33]研究表明，培養(yǎng)基pH值為5時，羅伊氏乳桿菌有較強的抗冷凍性，而pH值為6時抗冷凍性較差，說明低pH值可以增強菌株的抗冷凍性。此外對不飽和脂肪酸的成分進行分析發(fā)現(xiàn)，較低的pH值可以引起細胞內(nèi)不飽和脂肪酸的積累。Li Hua等[34]認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束時低的培養(yǎng)基pH值，更有利于合成環(huán)丙烷脂肪酸，可起到提高冷凍干燥存活率的作用。

在培養(yǎng)基中添加一些其他成分也有利于提高細胞膜中不飽和脂肪酸的含量，使細胞膜保持好的流動性。Fonseca等[35]的研究表明，在培養(yǎng)基中添加吐溫-80可以改善乳球菌和乳桿菌的活性，增加細胞膜中不飽和脂肪酸的組成，從而改變細胞膜的流動性，減少冷凍干燥過程中的死亡率。

細胞膜脂肪酸氧化的后果是自由基的形成，這是細胞死亡的主要原因之一。因此為防止細胞膜中不飽和脂肪酸在貯藏期間的氧化，預(yù)培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基中添加微量元素、VE、VC等也有利于清除自由基來減少氧化反應(yīng)。同時處理冷凍干燥樣品的過程中避免高氧、輻射、化學(xué)污染以及不良環(huán)境因素有助于減少不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)。添加冷凍干燥保護劑也是在處理凍干樣品中不可或缺的一步，谷胱甘肽能夠清除掉細胞內(nèi)的自由基，是一種重要的抗氧化劑，其通過巰基與自由基結(jié)合，可直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的排泄，并能激活多種酶從而促進糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。

3 冷凍干燥對酶類物質(zhì)及蛋白質(zhì)的影響

3.1 冷凍干燥對酶的影響

研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)酶的活力決定了細菌的物質(zhì)、能量代謝和生長速度[27]。而冷凍干燥會導(dǎo)致一些乳酸菌的酶活力顯著降低，如過氧化氫酶、乳酸脫氫酶、磷酸甘油脫氫酶、ATP酶、脂酶等，這會對菌體的活性造成影響，甚至導(dǎo)致其死亡。造成酶活力降低的主要原因是溶質(zhì)的濃縮效應(yīng)和細胞的脫水效應(yīng)。在凍干過程中，水的凍結(jié)及蒸發(fā)使得細胞間隙內(nèi)的溶質(zhì)逐漸被濃縮，電解質(zhì)的濃度隨之增加，由于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)對電解質(zhì)極為敏感，尤其是高濃度的電解質(zhì)存在時會引起蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變[36]，進而導(dǎo)致酶喪失其功能，造成菌種的活力下降[37]。

冷凍干燥會使一些維持胞內(nèi)pH值的酶類失活[38]。例如，K+-ATPase可以使橫跨膜產(chǎn)生電勢，K+與H+互換，起到維持pH值梯度的作用，而冷凍干燥使K+-ATPase失去了這種作用，破壞了pH值的動態(tài)平衡，導(dǎo)致胞內(nèi)pH值的降低，從而影響了酶的活力。另外，ATP合成酶要通過質(zhì)子梯度為ATP的合成提供能量[39]；冷凍干燥后這種質(zhì)子梯度被破壞，ATP合成酶的活力減弱，對菌體細胞的生理功能造成影響。冷凍干燥造成的酶活力降低會影響乳酸菌的生長，通過研究德氏乳桿菌保加利亞亞種的冷凍損傷機制，人們發(fā)現(xiàn)受凍菌體的結(jié)構(gòu)損傷引起氨基酸轉(zhuǎn)運相關(guān)的酶活力降低，合成蛋白質(zhì)的速度變慢，代謝受到影響[2]。冷凍干燥對乳酸脫氫酶也有顯著性的影響，因此可以通過測定乳酸脫氫酶的活力來探究冷凍干燥對酶造成的損傷[40]。Li Chun等[41]指出冷凍過程中乳酸脫氫酶的失活是乳酸菌損傷的一個主要因素。乳酸脫氫酶是乳酸菌代謝的關(guān)鍵酶，正常發(fā)酵過程中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原為乳酸，其活力大小反映了菌株的產(chǎn)酸能力和能量代謝能力。

3.2 冷凍干燥對蛋白質(zhì)的影響

干燥過程會導(dǎo)致由脫水引起的細胞失活[42]，失水會破壞蛋白質(zhì)與水分子、細胞膜之間的相互作用力，導(dǎo)致維持蛋白質(zhì)正常三級結(jié)構(gòu)的作用力減弱，酶活力喪失，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，使其喪失功能[43]。在凍干細胞內(nèi)維持一定的水分含量是非常重要的，水分含量過低會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)不穩(wěn)定和失活[44]，但水分殘留過多時會引起細胞死亡。干燥后殘余水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高（高于5%），殘留的自由水和細胞的蛋白質(zhì)相互作用可造成蛋白質(zhì)特定構(gòu)象改變，從而影響菌體的凍干存活率。同時凍干產(chǎn)品過高的水分含量會大大降低乳酸菌的儲存穩(wěn)定性，縮短其儲存期。

3.3 維持酶及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的措施

當(dāng)微生物細胞正常生理代謝出現(xiàn)異常時，大量的不利物質(zhì)積累，這會對細胞內(nèi)酶活力產(chǎn)生較大影響。為了抑制冷凍干燥過程中酶類物質(zhì)的失活及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，細胞本身會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)。低溫條件下產(chǎn)生的冷應(yīng)激蛋白和蛋白酶能提高酶類物質(zhì)的活性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并能維持DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄、翻譯功能，降低冷凍干燥對乳酸菌的損傷。Sanders等[45]的實驗結(jié)果表明，乳酸乳球菌在8 ℃冷應(yīng)激處理48 h后的存活率比沒有冷處理的高20%。

除了自身應(yīng)激反應(yīng)之外，當(dāng)凍干脫水時，添加含有多羥基結(jié)構(gòu)的保護劑能夠代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹在蛋白表面，從而起到維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的作用[40]。在干燥和貯藏過程中，保護劑被廣泛用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。張玉華等[46]發(fā)現(xiàn)海藻糖通過氫鍵能夠作用于蛋白質(zhì)，代替失去的水與極性基團作用，維持菌體細胞的原有結(jié)構(gòu)和功能，提高菌體的凍干存活率。

4 冷凍干燥對遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

4.1 冷凍干燥對遺傳物質(zhì)的作用方式

在冷凍干燥過程中，遺傳物質(zhì)的損傷是細胞喪失活力的重要因素之一。原核生物的遺傳物質(zhì)都是以蛋白質(zhì)包裹DNA的復(fù)合形式存在的，冷凍干燥過程會引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降。在冷凍干燥過程中，水分含量的減少會導(dǎo)致溶質(zhì)濃度增加和電荷變化，使DNA內(nèi)部堿基對間的疏水作用減弱，影響遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性[47]。當(dāng)相對濕度降到75%時，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生可逆變化，而相對濕度在65%以下時，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)就會被破壞，從而導(dǎo)致其空間構(gòu)型發(fā)生變化。乳酸菌DNA超螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的下降會影響遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和DNA復(fù)制過程的破壞，進而導(dǎo)致菌種突變體的產(chǎn)生[48]。

干燥脫水過程會造成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基對間的氫鍵斷裂，而氫鍵斷裂會使DNA的糖苷鍵斷裂，使DNA發(fā)生脫嘌呤和脫嘧啶反應(yīng)，影響核苷酸的組成，導(dǎo)致DNA的修復(fù)酶發(fā)生錯誤，從而影響蛋白質(zhì)和酶的活力[49]。同時過度干燥會除去細胞中的自由水、結(jié)合水以及結(jié)構(gòu)水，使其表面的親水基團失去保護，直接和外界環(huán)境（包括O2）作用，造成DNA的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷。

為了探究冷凍干燥后D N A的結(jié)構(gòu)變化，Santivarangkna等[50]利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)研究了真空干燥對瑞士乳桿菌細胞的影響，脫水導(dǎo)致的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)改變是造成細胞生理損傷的主要原因之一。

4.2 提高遺傳物質(zhì)抗冷凍穩(wěn)定性的方法

為了防止DNA結(jié)構(gòu)的改變，菌體細胞在極端不利環(huán)境下，會產(chǎn)生冷凍誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，這種蛋白有助于維持DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，并且使細胞能更適應(yīng)低溫下的轉(zhuǎn)錄與翻譯[51]，從而提高了細胞對冷凍干燥的抵抗力。通過微膠囊包埋也可以維持乳酸菌細胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，Hlaing等[52]通過傅里葉變換紅外光譜測定鼠李糖乳桿菌微膠囊細胞的光譜變化，證明微膠囊可以對菌體細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)起到保護作用。此外Wang Lijun等[53]也證實菊粉微膠囊可以在冷凍干燥過程中對菌體遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性起到保護作用，并有效地提高了菌體的益生作用和菌種活力。

5 結(jié) 語

冷凍干燥過程雖然會引起菌體的失活甚至死亡，但在乳酸菌保存方面依然起到了很大的作用，通過探究乳酸菌的失活機制，并根據(jù)菌體的生理生化特點采取恰當(dāng)?shù)姆椒梢蕴岣呔昕估鋬龈稍镄阅堋?/p>