武春燕 馮福應(yīng)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

CCK-8kit、LPS、RNA 提 取 試 劑 盒 、GoScript reverse transcription mix Oligo （dT）、Thunderbird SYBRqPCRMix、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS（BI）、Anti-NFE2L2antibody、iNOSRabbitPolyclonal antibody、NF-κB RabbitPolyclonalantibody、HO-1 RabbitPolyclonalantibody、Anti-GAPDHMonoclonal Antibody、HRPaffinipureGoatAnti-RabbitigG （H+L）、HRPaffinipureGoatAnti-MouseigG（H+L）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、MouseIL-6ELISAkit（小鼠白細(xì)胞介素-6）、MouseTNF-α ELISAkit。 凍干機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、5480R低溫冷凍離心機(jī)、BG-power900型電泳儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀、普通 PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

蒙古口蘑采摘于內(nèi)蒙古錫盟的東烏旗，切片，凍干48h，取粉末100g加入1L80%的乙醇，室溫靜置72h，上清即為濃度100g/L的多糖提取物[1]。小鼠巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)條件：含10%FBS和1%體積雙抗的1640 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞活力測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰酶消化，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為 5×105個(gè)/ml，每孔 100μL，接種 12h 后加入不同濃度的TMPE，TMPE的濃度設(shè)定為0，0.01，0.1，1，10，100 μg/ml， 每組 6 個(gè)復(fù)孔，4h 后加入10μL CCK-8進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。

1.3.2 TMPE抗炎抗氧化性效果檢測(cè)。取接種好細(xì)胞的96孔板，加入LPS誘導(dǎo)，并設(shè)置空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組安排如下 LPS （1μg/ml） 組，LPS （1μg/ml）+TMPE（0.01μg/m）組 ，LPS （1μg/ml）+TMPE （0.1μg/ml）組 ，LPS （1μg/ml）+TMPE （1μg/ml）組，LPS （1μg/ml）+TMPE（1μg/ml）組，每組 6 個(gè)復(fù)孔，作用 24h 后，收集上清通過(guò)Griess法測(cè)定上清中的一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量，Elisa測(cè)定 TNF-α，IL-6 的含量。

1.3.3 RNA及蛋白的提取、反轉(zhuǎn)錄及定量。取接種密度為1×106個(gè)/ml，每孔接種1mL的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h后加入LPS及TMPE刺激12h，收集細(xì)胞并提取RNA和蛋白。RNA及蛋白的提取，cDNA合成，mRNA定量均按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物退火溫度均為60℃，至少4個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行表達(dá)量分析。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.3.4 免疫印跡。提取的蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白的濃度，免疫印跡標(biāo)準(zhǔn)方案就行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。選用單因素方差分析 （ANOVA LSD），DUNCAN多重比較進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活力檢測(cè)

TMPE對(duì)細(xì)胞的影響進(jìn)行評(píng)估，表2顯示與未經(jīng)處理的細(xì)胞對(duì)照組相比，在濃度0.01～10μg/ml的TMPE濃度范圍內(nèi)觀察到的細(xì)胞存活率隨著劑量增加而增加，在TMPE最大濃度為100μg/ml的時(shí)候，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比會(huì)顯著降低 （P＜0.05）。在TMPE濃度為0.1，1和10μg/ml時(shí)與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.05），在 10μg/ml時(shí) TMPE 顯示出最高的存活率（152%）。

表2 不同濃度下細(xì)胞存活率

2.2 TMPE對(duì)NO生成的影響

檢測(cè)TMPE對(duì)NO生成的抑制效果，結(jié)果顯示如圖1。從圖中可以確定LPS誘導(dǎo)的RAW264.5細(xì)胞，NO的生成量相比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型中加入不同濃度的TMPE （0.01、0.1、1 和 10μg/ml），NO 的產(chǎn)生量相比LPS模型組均顯著降低 （P＜0.05）（NO的抑制率分別是28.45%，54.48%，58.24%和75.45%）。

圖1 不同處理下NO的產(chǎn)量

2.3 TMPE對(duì)TNF-α和IL-6的影響

檢測(cè)TMPE對(duì)TNF-α和IL-6生成的抑制效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖表明，LPS誘導(dǎo)的模型組中，TNF-α和IL-6的含量均顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），加入0.01、0.1、1、10 μg/mL 濃度的 TMPE 后均能顯著降低TNF-α （抑制率分別是 41.20%、54.93%、60.02%、67.70%）和IL-6的產(chǎn)生 （抑制率分別是42.48%、58.47%、74.75%、79.08%）（P＜0.05）。 綜合細(xì)胞活力，NO生成量實(shí)驗(yàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。TMPE的濃度在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，確定為在10μg/ml。

圖2 不同處理下TNF-α和IL-6的含量

2.4 基因表達(dá)量檢測(cè)

用10μg/mL的TMPE處理RAW264.7細(xì)胞，檢測(cè)mRNA表達(dá)量結(jié)果見(jiàn)圖3。與空白組相比，LPS模型組相關(guān)炎癥基因 （NFE2L2、 iNOS、HO-1、NF-κB）的表達(dá)量均顯著提高 （P＜0.05），在 LPS+TMPE（10 μg/ml）組中，相關(guān)基因的表達(dá)量除NF-κB基因外，其他基因（NFE2L2、iNOS、HO-1）的表達(dá)量與 LPS模型組均顯著降低（P＜0.05），但是 NFE2L2、 iNOS和 HO-1基因的表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

用10μg/mL的TMPE處理細(xì)胞，免疫印跡結(jié)果見(jiàn)圖4，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)TMPE對(duì)相關(guān)蛋白（NFE2L2、iNOS、HO-1、NF-κB） 表達(dá)的影響，LPS 模型組與對(duì)照組相比炎癥及抗氧化性相關(guān)蛋白（NFE2L2、iNOS、HO-1、NF-κB） 的表達(dá)量均有所增加，其中iNOS和NFE2L2的蛋白增加量最多，NF-κB蛋白表達(dá)量增加次之。LPS+TMPE組與LPS模型組相比，除NF-κB蛋白變化不明顯，其他蛋白（NFE2L2、iNOS、HO-1）的表達(dá)量均有降低。

圖4 免疫印跡結(jié)果

3 討論

食用菌品種繁多，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含有多種生物活性物質(zhì)如：高分子多糖、RNA復(fù)合體、天然有機(jī)鍺、核酸降解物、cAMP和三萜類化合物等，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖血脂等藥用功能，對(duì)維護(hù)人體健康有重要的價(jià)值。稀有、綠色、純天然的野生蒙古口蘑，倍受大家的追捧。研究表明蘑菇多糖提取物具有抗炎抗氧化等多種藥理活性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW 264.5細(xì)胞的模型，檢測(cè)TMPE對(duì)細(xì)胞存活率、NO產(chǎn)生抑制率及炎性因子TNF-α和IL-6生成的抑制影響，在濃度10μg/ml的TMPE作用下顯示出最高的細(xì)胞存活率（152%），NO的最大抑制效果（75.45%），TNF-α和 IL-6生成最大的抑制效果 （分別為67.70%，79.80%）。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW264.5的炎癥模型，發(fā)現(xiàn)蒙古口蘑多糖提取物在不同濃度下具有不同的抗炎抗氧化活性，通過(guò)對(duì)NFE2L2、NF-κB、HO-1和iNOS基因及蛋白的檢測(cè)，確定蒙古口蘑多糖提取物通過(guò)NFE2L2/HO-1信號(hào)通路，而不主要通過(guò)NF-κB信號(hào)通路，抑制炎癥因子TNF-α、IL-6和NO的釋放，進(jìn)而發(fā)揮抗炎抗氧化的作用。