錢 青 高春巖 申宇鴻 宋世珅 于建秀 于月紅

慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria，CSU)是一種常見的皮膚疾病，其特征是持續(xù)6周以上、反復(fù)出現(xiàn)皮膚風(fēng)團伴瘙癢[1]。異常活化的肥大細胞(mast cells，MC)可釋放組胺等炎癥介質(zhì)到組織和/或血管系統(tǒng)中，擴張血管及增加血管滲透性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞高表達血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)等黏附分子，加重炎性反應(yīng)[2]。近期研究表明，白細胞介素-35(Interleukin，IL-35)可發(fā)揮免疫抑制作用，但關(guān)于其對CSU患者血管內(nèi)皮細胞VCAM-1的作用則缺乏研究。本次研究通過檢測CSU患者外周血中IL-35與VCAM-1濃度；并經(jīng)體外實驗用CSU患者血清與肥大細胞共培養(yǎng)的上清液活化血管內(nèi)皮細胞，分析IL-35對血管內(nèi)皮細胞VCAM-1活化的抑制作用，探討IL-35在慢性自發(fā)性蕁麻疹疾病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2018年3月在北京市和平里醫(yī)院新診斷的CSU患者30例，并收集30名體檢中心體檢人群作為健康對照組(HC)。納入標準：根據(jù)2014年中國蕁麻疹診療指南[3]收集CSU患者入組，并根據(jù)蕁麻疹病情活動評分(Urticaria disease activity score，UAS)評估病情嚴重程度。排除標準：既往有其他皮膚過敏性疾病、高血壓、糖尿病、腎臟疾病、慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、服用抗組胺藥物、凝血調(diào)節(jié)藥物(如阿司匹林)等、近期服用免疫抑制劑或行抗感染治療，合并其他病毒感染。兩組患者年齡、性別均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批準號06/2017)，征得參加者監(jiān)護人知情同意。

表1 研究對象研究資料

1.2 儀器和試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人VCAM-1單克隆抗體(mAb)、紅細胞裂解液及流式細胞分析儀均購自美國BD 公司。人肥大細胞(HMC-1)購自上海信裕生物科技公司。RPMI 1640培養(yǎng)液、M199培養(yǎng)液及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco。細胞因子IL-35及sVCAM-1試劑購自美國Bio-rad公司。鈣黃綠素購自美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 患者治療前采集靜脈血3 mL，離心收集血清，儲存在-80℃，用于檢測IL-35、sVCAM-1濃度和體外實驗。

1.3.2 根據(jù)UAS評估病情嚴重程度，皮膚風(fēng)團直徑<3 cm，數(shù)量<10個，0分；10～50個直徑<3 cm的小風(fēng)團或10個以下直徑≥3 cm的大風(fēng)團，1分；50個以上直徑<3 cm小風(fēng)團或者10～50個直徑≥3 cm的大風(fēng)團，2分；風(fēng)團幾乎累及全部軀體，3分。瘙癢程度：無瘙癢，0分；輕度瘙癢，1分；中度瘙癢，2分；重度瘙癢，3分。UAS評分總分為0～6分，0～2分為輕度，2～4分為中度，4～6分為重度。

1.3.3 外周血IL-35和sVCAM-1檢測 對儲存于-80℃的血清進行復(fù)溶，避免反復(fù)凍融，利用Luminex液相芯片檢測IL-35和sVCAM-1濃度，每個標本檢測3次，取均值。

1.3.4 肥大細胞培養(yǎng)上清液制備 用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸混勻HMC-1細胞，終濃度為2×105/mL，取500 μL接種于細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL患者或健康對照者血清，在37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清液，用于體外實驗。

1.3.5 人靜脈血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 取健康孕婦分娩時的臍帶，用0.25%胰蛋白酶分離人靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)，接種于含10%FBS的M199完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。待細胞長至80%融合狀態(tài)后，選取第3代細胞用于實驗。上述培養(yǎng)的HUVECs分5組：空白對照組(僅含RPMI 1640培養(yǎng)液)、健康人上清液組(HC)、CSU上清液組(CSU)、HC+IL-35組、CSU+IL-35組，HC及CSU上清液組加入20%(v/v) MC上清液，HC+IL-35、CSU+IL-35上清液組加入20 ng/mL IL-35和20%(v/v)MC上清液，培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌二次，用于下一步實驗。

1.3.6 預(yù)實驗選擇IL-35濃度 通過預(yù)實驗選擇IL-35實驗濃度，IL-35終濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL與CSU培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)(n=5)，通過流式細胞術(shù)(FCM)檢測各組內(nèi)皮細胞VCAM-1表達。

1.3.7 流式細胞術(shù)檢測HUVECs VCAM-1表達 上述細胞，用100 μL PBS緩沖液重懸，加入10 μL FITC-鼠抗人VCAM-1，室溫環(huán)境下避光孵育30 min，PBS洗滌二次，并用400 μL PBS緩沖液重懸，流式細胞術(shù)檢測HUVECs VCAM-1陽性百分率。

1.3.8 熒光檢測單個核細胞黏附內(nèi)皮細胞 抽取健康人外周血10 mL，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)，取白膜層，PBS洗滌二次，置37℃溫育1 h，去除懸浮細胞，調(diào)整濃度至3×105/mL，加入5 μmol/L鈣黃綠素，37℃溫育30 min。上述經(jīng)MC上清液和IL-35刺激培養(yǎng)的HUVECs，每孔加入鈣黃綠素標記好的健康人PBMCs，37℃溫育20 min。吸去上清及未黏附的細胞，PBS洗孔2次，熒光顯微鏡下拍照。最后，加入細胞裂解液裂解細胞，吸取裂解液，用熒光分光光度計測定熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1濃度檢測 與HC組相比，CSU患者組血清IL-35濃度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與HC組相比，CSU患者組血清sVCAM-1濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1a、b。

2.2 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1相關(guān)性分析 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1濃度呈負相關(guān)(r=-0.5232，P=0.003)。見圖2。

2.3 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1與臨床癥狀評分相關(guān)性分析 CSU患者血清IL-35濃度和CSU臨床癥狀評分呈負相關(guān)(r=-0.5406，P=0.0020)；血清sVCAM-1濃度與CSU臨床癥狀評分呈正相關(guān)(r=0.4883，P=0.0062)。見圖3a、b。

2.4 預(yù)實驗選擇IL-35濃度 通過FCM法檢測內(nèi)皮細胞VCAM-1表達，IL-35在濃度為20 ng/mL時，對VCAM-1的抑制作用明顯，選擇20 ng/mL進行后續(xù)的實驗。見圖4。

圖1 1a：CSU患者血清sVCAM-1濃度；1b：CSU患者血清IL-35濃度圖2 血清IL-35和sVCAM-1相關(guān)性分析

圖3 3a：血清IL-35與USA評分相關(guān)性分析；3b：sVCAM-1濃度與USA評分相關(guān)性分析 圖4 IL-35濃度梯度分析

2.5 IL-35對血管內(nèi)皮細胞VCAM-1表達的抑制作用 與空白對照組相比，CSU上清液組內(nèi)皮細胞VCAM-1表達陽性率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與CSU上清液組相比，IL-35+CSU上清液組內(nèi)皮細胞VCAM-1表達陽性率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與空白對照組相比，HC上清液組內(nèi)皮細胞VCAM-1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；流式分析見圖5a，檢測結(jié)果見圖5b。

2.6 IL-35對單個核細胞黏附血管內(nèi)皮細胞的抑制作用 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組少量單個核細胞黏附于HUVECs(圖6a)，CSU上清液組單個核細胞黏附顯著增加(圖6b)，IL-35+CSU上清液組與CSU上清液組相比，單個核細胞黏附顯著降低(圖6c)；通過熒光分光光度計檢測，與空白對照組相比，CSU上清液組熒光強度顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與CSU上清液組相比，IL-35+CSU上清液組熒光強度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖6d。

圖5 5a:FCM檢測內(nèi)皮細胞VCAM-1表達;5b:VCAM-1陽性率比較

圖6 6a：空白對照組；6b：CSU上清液組；6c：IL-35+CSU上清液組

*P<0.05，CSU上清液組vs空白組；**P<0.05，CSU上清液+IL-35組vs CSU上清液組

圖6 6d HUVECs與單個核細胞黏附熒光強度比較

3 討論

慢性自發(fā)性蕁麻疹是一種常見的皮膚病，發(fā)病率為0.5%～1%[4]，特點是瘙癢、血管性水腫或兩者同時存在≥6周，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，加重患者經(jīng)濟負擔(dān)[5，6]。CSU發(fā)病機制復(fù)雜，涉及自身免疫、自身過敏和凝血異常等因素。目前抗組胺藥仍是CSU的基礎(chǔ)用藥，1代抗組胺藥受體選擇性差，長期用藥對患者學(xué)習(xí)和認知能力有一定的影響，2代抗組胺藥不良反應(yīng)少，是目前國內(nèi)外推薦的一線藥物，但針對常規(guī)劑量控制不好的患者，需加大劑量最高至常規(guī)劑量的四倍，對患者生理心理造成一定的影響[7]。因此，迫切需要找到新的治療方法。

血管內(nèi)皮細胞異常活化是慢性自發(fā)性蕁麻疹疾病的主要機制。肥大細胞活化內(nèi)皮細胞，高表達血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子，促進炎癥細胞黏附，聚集的白細胞釋放氧自由基、炎性介質(zhì)、細胞因子等直接損傷內(nèi)皮細胞，從而加重炎性反應(yīng)。細胞表面VCAM-1和ICAM-1脫落形成可溶性粘附分子(如sVCAM-1和sICAM-1)，可作為內(nèi)皮功能障礙的生物標志物[8]。本次研究發(fā)現(xiàn)CSU患者血清sVCAM-1濃度升高，且與CSU臨床癥狀評分呈正相關(guān)，表明CSU患者血管內(nèi)皮細胞活化參與疾病過程。

IL-35 是由p35和EBI3兩個亞單位組成的異源二聚體，屬IL-12細胞因子家族成員，具有免疫調(diào)節(jié)作用[9]，可促進誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)增殖，抑制Th17細胞免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)，CSU患者外血清細胞因子IL-35濃度降低，且和CSU臨床癥狀評分、血清sVCAM-1濃度呈負相關(guān)。與本次研究一致的是，郭敏等[11]用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測CSU患者外周血，發(fā)現(xiàn)CSU患者組血清IL-35濃度明顯低于健康對照組，而IL-17濃度明顯高于健康對照者。

為了進一步闡明IL-35對內(nèi)皮細胞VCAM-1的抑制作用，本次研究通過體外實驗建立CSU患者活化的內(nèi)皮細胞模型。首先將患者血清(20%，v/v)直接活化血管內(nèi)皮細胞，通過流式細胞術(shù)檢測VCAM-1表達，并與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)未顯示)，CSU患者血清與肥大細胞共培養(yǎng)的上清液可顯著誘導(dǎo)人HUVECs細胞高表達VCAM-1。與本次研究一致的是，Bossi等[12]證實，以CSU患者血清培育的MC細胞懸液可明顯增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，此機制不依賴于IgE和IgG。上述結(jié)果均表明CSU患者血清可活化肥大細胞，分泌活性物質(zhì)，進而活化血管內(nèi)皮細胞。

CSU患者血清誘導(dǎo)肥大細胞釋放介質(zhì)活化血管內(nèi)皮細胞可能有下列機制：首先，30%～40%CSU患者存在自體血清皮膚試驗陽性[13]；用含抗FcεR Iα自身抗體的血清孵育肥大細胞(MC)，可使MC脫顆粒釋放組胺、白三烯，合成和釋放前列腺素(PG-)D2，血栓素，白三烯(LT)和血小板活化因子(PAF)，這些介質(zhì)舒張血管，增加血管通透性和刺激皮膚感覺神經(jīng)末梢，從而導(dǎo)致皮膚腫脹、發(fā)紅和發(fā)癢[14]。其次，CSU患者血清內(nèi)存在非自身抗體類循環(huán)組胺釋放因子。另外，凝血途徑激活可促進一些血管活性物質(zhì)釋放和形成，尤其是組胺和凝血酶，它們可以通過刺激血管內(nèi)皮細胞和肥大細胞脫顆粒而增加血管通透性[15]。

本次研究通過流式細胞術(shù)證實IL-35可抑制CSU患者血清與MC共培養(yǎng)的上清液對血管內(nèi)皮細胞VCAM-1的活化作用。與此一致的是，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，IL-35可抑制MC上清液誘導(dǎo)的單個核細胞黏附。有研究表明，IL-35在敗血癥小鼠模型中，可抑制脂多糖(LPS)活化內(nèi)皮細胞，其機制是通過活化細胞 MAPK-AP-1 信號通路，從而減少血管炎癥反應(yīng)[16]。

綜上所述，本次研究表明， CSU患者血清IL-35濃度顯著減低， sVCAM-1濃度升高。通過體外實驗證實，CSU患者血清與MC共培養(yǎng)的上清液可活化血管內(nèi)皮細胞VCAM-1的表達，而IL-35可抑制此活化過程。上述結(jié)果表明CSU患者IL-35濃度降低參與了血管內(nèi)皮細胞VCAM-1活化。因此，通過調(diào)控CSU患者血清IL-35水平，對肥大細胞活化的血管內(nèi)皮細胞具有保護作用，從而為蕁麻疹的治療提供幫助。但本次研究臨床樣本量稍偏少，后續(xù)研究將進一步探究IL-35對肥大細胞活化的血管內(nèi)皮細胞的保護作用及機制。