于遠東

河南省直第三人民醫(yī)院健康體檢中心，鄭州 450006

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占全部惡性腫瘤的1.7%，近年來其發(fā)病率呈逐年增長趨勢[1]。在甲狀腺癌中，腫瘤轉(zhuǎn)化可發(fā)生在腺體的濾泡中或濾泡旁細胞中。當轉(zhuǎn)化發(fā)生在腺體的濾泡中時，引起的甲狀腺癌主要包括乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡性甲狀腺癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）、Hürthle細胞癌、罕見的低分化甲狀腺癌（poorly differentiated thyroid carcinoma，PDTC）和間變性甲狀腺癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）。當轉(zhuǎn)化發(fā)生在濾泡旁細胞中時，引起的甲狀腺癌主要為甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）[2]。目前，針對甲狀腺癌的治療方法主要包括手術和放化療，但在大多情況下效果不理想。血清學檢測甲狀腺球蛋白和降鈣素水平是甲狀腺癌診斷和隨訪的重要手段，但這兩種標志物在靈敏度和準確度上具有局限性，因此探索新型的診斷甲狀腺癌的方法具有重要意義[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，近年來，越來越多的miRNA被報道參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。miRNA的表達模式可能代表了腫瘤的惡性程度，其異常表達是惡性腫瘤的重要標志。研究表明，特異性miRNA的表達改變參與某些惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。因此，miRNA表達譜可以為腫瘤的分類、診斷和預后評估提供依據(jù)。

1 miRNA與甲狀腺癌

細胞增殖、分化和凋亡對維持體內(nèi)細胞平衡具有重要意義，miRNA表達失調(diào)與細胞增殖的激活、凋亡信號通路的失活以及其他遺傳變化相關，最終導致腫瘤發(fā)生[6]。2005年，He等[7]首次報道了miRNA在甲狀腺癌發(fā)生中的作用。在甲狀腺癌中，miRNA的生物發(fā)生過程發(fā)生改變[8]。與正常甲狀腺組織和良性甲狀腺腫瘤組織相比，惡性甲狀腺腫瘤組織中參與miRNA形成的Dicer mRNA下調(diào)，這種改變與腫瘤的侵襲性相關，例如甲狀旁腺擴張、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移以及復發(fā)，并伴隨有BRAF（V600E）突變[9-10]。研究報道，RET突變型MTC患者中與miRNA生物發(fā)生相關的某些基因的表達水平高于RET野生型MTC患者，而RAS突變型和RAS野生型MTC患者中，這些基因的表達水平?jīng)]有差別[11]。

與正常甲狀腺組織相比，miRNA在甲狀腺癌組織中過表達或表達下調(diào)。在PTC組織中，miRNA-940、miRNA-15a、miRNA-16和 let-7b表達下調(diào)[12-13]；在FTC組織中，miRNA-663b、miRNA-137、miRNA-30c-1、miRNA-767-5p和miRNA-603過表達，miRNA-7、miRNA-1179、miRNA-7-2、miRNA-486-5p和miRNA-130b表達下調(diào)[14]；在ATC組織中，miRNA-125b、miRNA-148b-3p、miRNA-141-3p、miRNA-135a-5p和miRNA-19a-3p表達下調(diào)[15-16]；在MTC組織中，miRNA-21、miRNA-183和miRNA-375表達上調(diào)[17]。這些結(jié)果表明，miRNA表達失調(diào)與特定類型的甲狀腺癌有關。

2 生物樣本中miRNA的檢測

生物樣本中miRNA的表達模式含有豐富的信息，分析這些模式的變化可以為了解不同細胞的生理和病理改變過程提供重要線索[18]。許多疾病的發(fā)生都與相關組織中miRNA表達譜的改變有關，而且這種改變已在多種腫瘤中報道[19]。miRNA可以從多種生物樣本中分離得到，如細針穿刺活檢標本、冷凍組織塊、石蠟包埋切片、血清或血漿，且在這些樣本中具有很好的穩(wěn)定性。目前，常用的抽提方法包括化學法（如異丙醇沉淀）和過柱法，化學法的得率高但存在化學污染物，過柱法可以獲得高純度的RNA，但針對不同的樣品需要使用特定的提取試劑盒，將抽提獲得的RNA進行miRNA定量，隨后進行miRNA表達譜分析。常用的miRNA表達譜分析技術有表達芯片（microarray）、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、高轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和數(shù)字聚合酶鏈反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）（表1）。

表1 不同miRNA檢測技術的特點

3 miRNA用于甲狀腺癌的診斷

3.1 細針穿刺活檢和組織標本的miRNA分析

甲狀腺結(jié)節(jié)是最常見的甲狀腺疾病，在普通人群中，約50%具有超聲可測量的結(jié)節(jié)，在這些甲狀腺結(jié)節(jié)中，惡性的比例僅為5%[20]，因此術前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性至關重要，然而應用傳統(tǒng)的細針穿刺活檢和細胞學檢查進行鑒別的成功率有限。目前，多項研究致力于構建特定的miRNA診斷試劑盒，用于提高甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的診斷特異度和靈敏度。Nikiforova等[21]檢測了各種類型甲狀腺癌的miRNA表達譜，提出一組可以用于區(qū)分不同甲狀腺癌的miRNA，包括miRNA-146b、miRNA-155、miRNA-187、miRNA-197、miRNA-221、miRNA-222和miRNA-224。在62個細針穿刺活檢標本中，對這些選定的miRNA進行定量分析發(fā)現(xiàn)，當其中至少一種miRNA的表達上調(diào)2倍以上時，腫瘤檢測的靈敏度可達100%，而其特異度和準確度分別為94%和95%；當其中3個以上的miRNA表達上調(diào)時，腫瘤檢測的特異度可達100%，準確度提高到98%。進一步使用該組miRNA對141例細針穿刺活檢標本進行評估，結(jié)果顯示基于miRNA-146b、miRNA-155和miRNA-221表達的決策模型得到的陽性驗證率高達97.7%（其中59%的結(jié)節(jié)性質(zhì)在細胞學水平不能判定），且可靠度達78.4%[22]。

3.2 循環(huán)miRNA分析

甲狀腺癌患者中特異性表達失調(diào)的miRNA會分泌進入血液循環(huán)，使其可能成為一種非侵入性的腫瘤標志物。一項研究分析了血液循環(huán)中已應用于臨床檢測的miRNA-146b、miRNA-155、miRNA-221和miRNA-222的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與良性對照組相比，PTC組中miRNA-146b和miRNA-155的表達水平更高；miRNA-146b檢測PTC的靈敏度和特異度分別為61.4%和57.9%，miRNA-155檢測PTC的靈敏度和特異度分別為74.3%和63.2%；同時還發(fā)現(xiàn)miRNA-146b、miRNA-155和miRNA-222的表達水平與腫瘤大小呈正相關[23]。Rosignolo等[24]檢測了11例甲狀腺癌患者術前及術后30天的血液樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與20例健康對照者比較，甲狀腺癌患者術后的miRNA-146a-5p和miRNA-221-3p表達水平顯著升高。另有研究報道，F(xiàn)TC患者血漿中的miRNA-21表達水平高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者或PTC患者[25]。另一項關于血漿miRNA表達譜的分析結(jié)果顯示，與甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者或健康者比較，PTC患者的miRNA-25-3p和miRNA-451a表達水平顯著升高，且采用這兩種miRNA鑒別PTC和甲狀腺良性結(jié)節(jié)時，靈敏度分別為92.8%和88.9%，特異度分別為68.8%和66.7%[26]。與此相反，有研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者的miRNA-451表達水平下調(diào)[27]。更重要的是，miRNA-451已經(jīng)明確與溶血相關，因此將其作為循環(huán)性標志物存在一定困難[28]。盡管如此，仍有研究表明，雖然甲狀腺癌組織中miRNA-145的表達水平較低，但血清和細針穿刺活檢標本中的miRNA-145可用于診斷甲狀腺癌[29]。

4 miRNA作為甲狀腺癌的預后標志物

miRNA的表達也有可能作為判斷甲狀腺癌患者臨床結(jié)局的一個預后因素。雖然PTC患者的病死率相對較低，但20%的患者會發(fā)生淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移，導致患者的遠期結(jié)局惡化[30]。應用靈敏度高的生物標志物可以篩選這些患者，對其健康狀況進行監(jiān)控并進行及時治療。研究顯示，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的miRNA-221、miRNA-21、miRNA-146a和miRNA-146b表達水平顯著升高[31-33]。miRNA-146b過表達的甲狀腺癌患者總體生存率明顯低于miRNA-146b表達水平較低的患者，miRNA-146b過表達可顯著提高腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并使腫瘤細胞對化療誘導的細胞凋亡產(chǎn)生耐藥性[34]。研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a、miRNA-146b和miRNA-221的表達水平與甲狀腺癌患者的TNM分期呈正相關[35-36]。對于PTC患者，miRNA-146b的過表達會促進細胞增殖，增加復發(fā)風險[37]。在PTC患者中，miRNA-146b-5p表達顯著升高，而這種現(xiàn)象在其他類型的甲狀腺癌組織中是不存在的，提示miRNA-146b-5p可以作為PTC診斷和預后評估的標志物[38]。miRNA-21和miRNA-9與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能相關，可以較好地預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；miRNA-181a-2-3p和miRNA-99b-3p可用于預測濾泡型甲狀腺乳頭狀癌患者的無復發(fā)生存期，對診斷和預后預測具有潛在的應用價值[39]。這些研究結(jié)果表明，miRNA具有作為生物標志物的潛能，可非侵入式監(jiān)測甲狀腺的狀態(tài)和甲狀腺癌的復發(fā)。

5 miRNA作為甲狀腺癌治療的潛在靶點

miRNA在腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA及其加工復合體直接參與上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）和p120連環(huán)蛋白介導的細胞黏附[40]。與遺傳改變不同，miRNA表達的變化可以被調(diào)整，因此腫瘤患者中miRNA表達水平的顯著失調(diào)是一個潛在的治療靶點。針對上調(diào)的miRNA，可以使用特異性的抑制劑或體外合成其反義miRNA調(diào)整其生物學效應。對于低表達水平的miRNA，可以導入人工合成的成熟miRNA分子直接使其表達上調(diào)，也可以導入質(zhì)粒表達的初始miRNA分子或前體分子。有研究證實，在使用恢復miRNA-150表達的甲狀腺癌細胞系構建的小鼠模型中，腫瘤細胞的增殖被顯著抑制[41]。小鼠模型的研究肯定了miRNA靶向治療的潛在應用價值，然而要直接進入臨床試驗還有很多問題亟待解決。

6 小結(jié)與展望

miRNA表達失調(diào)在甲狀腺癌的發(fā)生過程中至關重要，其作為甲狀腺癌的診治和預后評估標志物具有潛在的應用價值，特異性miRNA的檢測可以明顯提高甲狀腺癌診斷的靈敏度和準確度，目前尚未見到將miRNA應用于甲狀腺癌治療的臨床報道，然而大量的功能性研究和臨床前研究已經(jīng)揭示了miRNA用于甲狀腺癌診斷和治療的巨大潛在價值。甲狀腺癌患者中的miRNA具有顯著的腫瘤抑制效應，其作用并不局限于調(diào)控甲狀腺癌細胞的生長，在輔助治療時也能發(fā)揮作用。對于臨床前研究，關注點大部分聚焦在PTC上，各科研工作者使用當前常用的小鼠動物模型，經(jīng)體外實驗獲取PTC中miRNA的調(diào)整數(shù)據(jù)，為臨床前研究提供了理論基礎。除了PTC這一亞型，關于其他亞型如FTC和PDTC中miRNA功能的研究較少。

循環(huán)miRNA是甲狀腺癌早期診斷、監(jiān)測和治療的理想分子標志物。與循環(huán)mRNA相比，循環(huán)miRNA更加穩(wěn)定，并具有組織特異性，因此是一種更有價值的生物標志物。如果能夠改良miRNA的定量方法，確定循環(huán)miRNA的標準化定量，預期未來這一生物標志物將會廣泛應用于甲狀腺癌患者的早期診斷和個體化治療。