盧健榮

摘 要：采用同源克隆的方法對煙草品種K326中的一個(gè)SMC1A基因進(jìn)行了研究，組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因在成熟期的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高。有研究表明，該基因的穩(wěn)定表達(dá)對低鉀、高鹽、干旱、ABA均有響應(yīng)表達(dá)，試驗(yàn)成功構(gòu)建了pET32a-SMC1A過表達(dá)載體。研究結(jié)果能為解析SMC1A在響應(yīng)逆境脅迫的功能奠定一定理論

基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：煙草SMC1A 克隆 生物信息學(xué) 基因表達(dá)

染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白（SMC蛋白，structural maintenance of chromosome proteins），與染色體結(jié)構(gòu)細(xì)胞周期性的動(dòng)態(tài)變化緊密相關(guān)，它們參與有絲分裂染色體的集縮和分離、性染色體的劑量補(bǔ)償效應(yīng)、姐妹染色單體的內(nèi)聚作用、遺傳重組和DNA修復(fù)等過程[1]，具有一定的結(jié)構(gòu)保守性，可作用于染色體代謝的多個(gè)方面。

SMC蛋白普遍存在于各種生物中，盡管不同種類SMC蛋白的結(jié)構(gòu)有差異，但是它們具有一定的保守性[2]。通常，SMC蛋白是由1000到1500個(gè)氨基酸殘基組成的多肽并具有共同的結(jié)構(gòu)特征：N端核苷結(jié)合基序，中間兩個(gè)被鉸鏈隔開的螺旋區(qū)（可能與蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)），C端被命名為DA盒的保守序列。DA盒與ATP酶的特征基序非常相似，DA盒和N端ATP結(jié)合區(qū)共同組成ATP酶功能域，因此SMC蛋白是一類染色體ATP酶。

許多原核生物（包括細(xì)菌、古細(xì)菌）也具有編碼SMC蛋白的基因。革蘭氏陽性細(xì)菌枯草桿菌SMC基因的突變會(huì)導(dǎo)致無類核細(xì)胞的形成、類核結(jié)構(gòu)的破壞以及與染色質(zhì)分離相關(guān)的蛋白復(fù)合物的錯(cuò)誤組裝，這說明枯草桿菌的SMC基因產(chǎn)物與類核物質(zhì)的壓縮直接相關(guān)[3～5]。

SMC蛋白與染色體行為密切相關(guān)，它與不同亞基結(jié)合在多個(gè)方面影響染色體，本實(shí)驗(yàn)擬通過克隆煙草SMC1A基因，分析進(jìn)行其遺傳特性學(xué)及其生物信息學(xué)特性分析，為研究煙草基因組穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

煙草品種K326；原核表達(dá)載體pET-32a（+）；rans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和BL21（DE3）化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司）；T4 DNA Ligase、EcoR I-HF?和Not I-HF?限制性核酸內(nèi)切酶（New England Biolabs（NEB）公司 ）；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提中量試劑盒 （天根生化科技（北京）有限公司）

1.2方法

1.2.1 SMC1A基因引物設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI GenBank基因庫中SMC1A（NM_019710.2）基因序列設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)如下：

MC1A-F：ATGGGTTTCCTGAAACTGAT

MC1A-R：GCTATTGTTCATTGGGGTTGG

所設(shè)計(jì)引物送生物公司進(jìn)行合成。取煙草品種K326葉子，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR， RT-PCR），轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80℃冰箱。

通過PCR擴(kuò)增其基因，克隆至質(zhì)粒載體，對克隆得到的編碼基因進(jìn)行PCR鑒定及測序鑒定。具體體系和反應(yīng)條件如表1所示。

反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，參照2×TransTaq High Fidelity（HiFi） PCR SuperMix Ⅱ說明書的體系要求分別加入試劑，具體試劑參見表2所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。條帶正確則將目的位置PCR產(chǎn)物電泳條帶膠回收純化，膠回收方法具體操作參考天根膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.2.2.1 目的基因與表達(dá)載體連接

將轉(zhuǎn)有原核表達(dá)載體pET-32a（+）的細(xì)菌過夜培養(yǎng)，提取pET-32a（+）載體質(zhì)粒，提取方法見說明書。取pET-32a（+）質(zhì)粒和純化后的PCR產(chǎn)物，分別加入預(yù)先準(zhǔn)備好的EcoR I-HF?和Not I-HF?限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件為37℃ 4 h，65℃ 15 min，具體體系和反應(yīng)條件參考表3和表4。反應(yīng)結(jié)束后，對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并參考天根膠回收試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作參考說明書進(jìn)行?；厥蘸蟮臉悠钒茨柋?，載體：插入的DNA=1：7的比例加入，并添加1μL T4 DNA Ligase和2μL 10×buffer，1μL Nuclease-Free Water，總體系為20μL。置于4℃過夜反應(yīng)。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)化

反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入50 μL Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，反應(yīng)條件為冰浴20～30 min，42℃熱激1 min 30 s，冰浴2 min，然后加入200 μL無氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，于搖床上37 ℃，200 rpm培養(yǎng)1-2 h，再將菌液涂布于含氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天進(jìn)行陽性菌的篩選。

1.2.2.3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

陽性菌落的篩選，首先進(jìn)行PCR鑒定，將SMC1A基因和載體T7引物進(jìn)行組合，分別是SMC1A上游引物SMC1A- F與SMC1A下游引物SMC1A-R、載體上游引物T7 F與載體下游引物T7 R、SMC1A上游引物SMC1A-F與載體下游引物T7 R和SMC1A下游引物SMC1A-R與載體上游引物T7 F等四種組合方式。

1.2.2.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測序結(jié)果分析

鑒定正確后，將菌液加入到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，將菌液分成兩部分，一部分菌液按1：1的比例加入60%的甘油用于保種，一部分菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。測序結(jié)果先進(jìn)行NCBI GenBank庫比對，確定其正確性，然后利用軟件DNAMAN翻譯成氨基酸序列，再進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，如圖1結(jié)果顯示，在第1泳道750bp和1000bp間有一清晰條帶，大小與預(yù)測大小一致，說明該對引物可特異性擴(kuò)增出目的基因。

2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

挑取培養(yǎng)板上的菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示，表明在兩對引物的組合擴(kuò)增下，所選菌落在預(yù)測位置分別出現(xiàn)相應(yīng)的PCR片段，說明目的基因插入到表達(dá)載體的相應(yīng)位置。

2.3 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒在雙酶切消化反應(yīng)后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見，EcoR I-HF?和Not I-HF?酶切的1泳道中出現(xiàn)兩條條帶，一條大概為820 bp左右與SMC1A基因擴(kuò)增大小一致，另一條大小大概5789 bp是載體酶切后的片段；在兩個(gè)酶分別單酶切消化反應(yīng)的泳道2和3中，均只出現(xiàn)一個(gè)條帶，大小約為6691 bp；在無酶切消化反應(yīng)的泳道4中，由于質(zhì)粒的特殊結(jié)構(gòu)，一般出現(xiàn)二到三個(gè)條帶，結(jié)果如圖3所示。以上結(jié)果初步說明含有目的基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 重組質(zhì)粒測序鑒定及基因生物信息學(xué)分析

對測序結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)酶切位點(diǎn)位置，將其中的目的基因挑出，基因片段大小為810bp，基因序列如圖4所示，并與NCBI GenBank在線比對分析。建立遺傳進(jìn)化樹，由同源性分析發(fā)現(xiàn)，克隆的SMC1A基因與ZJ99株及MW9710株的同源較高，結(jié)果如圖5所示，說明本實(shí)驗(yàn)成功克隆SMC1A基因，序列已上傳至NCBI GenBank（ID： KX831117.1）。

3討論

本實(shí)驗(yàn)通過查找基因庫，初步克隆煙草品種K326中的SMC1A基因，成功克隆SMC1A基因，并分析得到其遺傳特性及其遺傳進(jìn)化樹。對其抗原表位、信號肽、跨膜區(qū)域、糖基化位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn)等生物信息學(xué)特性有一定的了解。相關(guān)研究表明，SMC1A基因的穩(wěn)定表達(dá)對低鉀、高鹽、干旱、ABA均有響應(yīng)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出pET32a-SMC1A表達(dá)載體，能為解析SMC1A在響應(yīng)逆境脅迫的功能奠定一定理論

基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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