張海靈，李顏顏，王小元

1 江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122

L-纈氨酸(L-valine) 是一種重要的支鏈氨基酸，是人體8種必需氨基酸之一，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料等領(lǐng)域[1]。目前工業(yè)上主要通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L-纈氨酸，生產(chǎn)菌株主要包括谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum、大腸桿菌Escherichia coli以及釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，谷氨酸棒狀桿菌由于產(chǎn)率高、生物安全等特性而被廣泛應用[2-4]。傳統(tǒng)誘變育種是L-纈氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌主要來源[5]，但是傳統(tǒng)的育種方式獲得的菌株遺傳背景不明確、菌株遺傳特性不穩(wěn)定，隨著谷氨酸棒狀桿菌生理學和遺傳學知識的積累，基于理性設(shè)計的代謝工程正在成為選育氨基酸高產(chǎn)菌株的主要方式，更多的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)特性得以改良，根據(jù)已經(jīng)獲得的遺傳學信息，系統(tǒng)分析菌株L-纈氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)，通過基因工程技術(shù)改造谷氨酸棒桿菌以提高L-纈氨酸的產(chǎn)量[6-7]。近年來，一些谷氨酸棒桿菌的基因敲除、表達系統(tǒng)已經(jīng)被構(gòu)建[8-13]，針對谷氨酸棒狀桿菌中的啟動子工程也已經(jīng)開展[11,14]。圍繞L-纈氨酸的生物合成途徑，谷氨酸棒狀桿菌中的理性代謝工程設(shè)計從 DNA層次上的定點突變以消除轉(zhuǎn)錄弱化調(diào)控和改變啟動子活性、蛋白層次上改造酶的催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、強化通往 L-纈氨酸的碳代謝流以及加強 L-纈氨酸的胞外轉(zhuǎn)運等幾個方面展開[15]。

在前期的研究中，我們選育了一株L-纈氨酸產(chǎn)量較高的谷氨酸棒狀桿菌VWB-1，通過對其進行轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學的分析研究其遺傳背景，發(fā)現(xiàn)菌株的產(chǎn)酸水平有待進一步提高[16]。本研究中，借助代謝工程改造的技術(shù)手段，我們首先在谷氨酸棒狀桿菌 L-纈氨酸高產(chǎn)菌株 VWB-1中對丙氨酸合成途徑丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因alaT進行敲除，發(fā)現(xiàn)丙氨酸合成途徑的阻斷能夠降低細胞內(nèi)雜酸丙氨酸的生成。其次，對L-纈氨酸合成代謝限速酶乙酰羥酸合酶(AHAS) 進行抗反饋抑制的定點突變，解除L-纈氨酸對該酶的反饋抑制，進而通過過量表達L-纈氨酸合成途徑基因加強通往L-纈氨酸的碳代謝流。最后，表達與 L-纈氨酸轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因加強菌株的 L-纈氨酸轉(zhuǎn)運能力。通過搖瓶發(fā)酵和5 L罐發(fā)酵實驗，檢測重組工程菌株的產(chǎn)L-纈氨酸水平。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所采用的菌株和質(zhì)粒見表 1。pECXK99E載體為E.coli和C.glutamicum穿梭表達載體[17]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

大腸桿菌E.coliJM109 使用LB培養(yǎng)基(酵母浸提物 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L；固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉 20 g/L) 進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 37 ℃。谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicumATCC 13869和VWB-1使用LBGB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基中添加5 g/L葡萄糖以及18.5 g/L腦心浸液) ，培養(yǎng)溫度為30 ℃。C.glutamicum感受態(tài)制備培養(yǎng)基(酵母浸提物0.5 g/L，蛋白胨 1 g/L，NaCl 1 g/L，甘氨酸3%，吐溫800.1%)，C.glutamicum電轉(zhuǎn)化恢復培養(yǎng)基LBHIS(酵母浸提物 2.5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，D-山梨醇 91 g/L，腦心浸液18.5 g/L；固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉 20 g/L)。必要時添加質(zhì)量濃度為30 μg/mL的卡那霉素。大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化方法參照文獻[18]，谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化方法參照文獻[12]。

表1 本研究所用質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.3 突變菌株、定點突變、重組載體和基因重組菌構(gòu)建

本研究所用引物序列及相關(guān)信息見表 2。引物主要依據(jù)C.glutamicumATCC 13032基因組序列設(shè)計[19]，ilvN1M13突變相關(guān)引物ilvNM13-F/ilvNM13-R根據(jù)VWB-1相關(guān)基因測序結(jié)果設(shè)計。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.3.1 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因alaT敲除突變菌株的構(gòu)建

應用sacB基因的條件致死性原理，進行VWB-1丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因alaT的敲除。利用基于sacB的整合型敲除載體pK19mobsacBalaT(德國尤里希生物技術(shù)研究中心Lothar Eggeling教授提供)[20]，對菌株VWB-1進行alaT敲除，谷氨酸棒狀桿菌alaT基因敲除方法參照文獻[12]。獲得了不含有kan抗性的無痕基因敲除突變菌株VWB-1/ΔalaT(命名為 VWB-2)。

1.3.2 乙酰羥酸合酶調(diào)節(jié)亞基IlvN定點突變

前期測序結(jié)果表明，VWB-1來源的ilvBN(標記為ilvBN1) 編碼的乙酰羥酸合酶(標記為AHAS1) 蛋白相比于ATCC 13869來源的ilvBN編碼的乙酰羥酸合酶蛋白，氨基酸序列并非完全一致。如圖 1所示，分別以C.glutamicumATCC 13869和VWB-1的基因組為模板擴增ilvBN相關(guān)基因。以ilvBN-F和ilvBN-R為引物分別擴增ilvBN和ilvBN1，將獲得的PCR片段與載體pEC-XK99E共同進行EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切并純化，在 T4 DNA連接酶作用下進行連接，構(gòu)建得到載體pEC-XK99E-ilvBN和pEC-XK99E-ilvBN1。分別以構(gòu)建好的重組載體 pEC-XK99E-ilvBN和 pECXK99E-ilvBN1為模板，以ilvNM13-F/ilvNM13-R為引物，進行全質(zhì)粒擴增，PCR反應結(jié)束，直接在PCR反應體系中加入1 μLDpnⅠ，混勻后30 ℃孵育 1 h。DpnⅠ消化結(jié)束后直接轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化后的細胞全部涂布到含有適當抗生素的平板上，過夜培養(yǎng)。挑取生長后的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行酶切驗證，確認得到的質(zhì)粒大小正確以后，對該質(zhì)粒進行測序，比對測序結(jié)果，鑒定突變是否成功。突變成功后的載體命名為 pEC-XK99E-ilvBNM13和 pEC-XK99E-ilvBN1M13。

1.3.3 L-纈氨酸合成途徑相關(guān)基因的串聯(lián)表達

如圖1所示，以C.glutamicumVWB-1基因組為模板，以ilvC-F/ilvC-R為引物，擴增獲得目的基因ilvC，將ilvC片段和pEC-XK99E-ilvBN1M13分別進行雙酶切，在T4 DNA酶的作用下進行連接，得到新載體pEC-XK99E-ilvBN1M13C。繼而分別以C.glutamicumVWB-1基因組ilvD-F/ilvD-R、ilvE-F/ilvE-R為引物，克隆得到ilvD和ilvE，將ilvD和ilvE各自進行XbaⅠ酶切，與同樣經(jīng)XbaⅠ酶切的載體pEC-XK99E-ilvBN1M13C進行連接。連接反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到E.coliJM109感受態(tài)細胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒酶切驗證，同時測序驗證片段的連接順序。構(gòu)建分別得到 pEC-XK99E-ilvBN1M13CD和pEC-XK99E-ilvBN1M13CE。

1.3.4 L-纈氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因的串聯(lián)表達

如圖1所示，以陳誠等[21]構(gòu)建的載體pJYW-4-lrp1-brnFE為模板，以Ptac-lrp1-brnFE-F/Ptac-lrp1-brnFE-R為引物，擴增得到lrp1和brnFE上游均含有 PtacM啟動子序列的片段 PtacM-lrp1-brnFE，將該片段用NdeⅠ進行酶切，在T4 DNA連接酶的作用下，與同樣經(jīng)NdeⅠ酶切的載體 pECXK99E-ilvBN1M13CD和pEC-XK99E-ilvBN1M13CE進行連接，轉(zhuǎn)入到E.coliJM109感受態(tài)細胞。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒酶切驗證，同時測序驗證片段的連接順序。構(gòu)建得到新載體命名為 pEC-XK99E-ilvBN1M13CD-lrp1-brnFE和pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE。

1.4 谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵用培養(yǎng)基和發(fā)酵條件

1.4.1 種子培養(yǎng)基

30 g/L葡萄糖，1 g/L KH2PO4，0.4 g/L MgSO4，10 mg/L FeSO4，10 mg/L MnSO4，20 g/L(NH4)2SO4，40 g/L尿素，60 ml/L大豆浸出液，0.1 g/L DL-甲硫氨酸，50 μg/L生物素，200 μg/L維生素B1。NaOH調(diào)pH為6.3，121 ℃滅菌20 min。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

120 g/L葡萄糖，1 g/L KH2PO4，0.4 g/L MgSO4，10 mg/L FeSO4，10 mg/L MnSO4，40 g/L(NH4)2SO4，10 mL/L大豆浸出液，0.7 g/L DL-甲硫氨酸，50 μg/L生物素，300 μg/L維生素B1，0.25 g/L L-異亮氨酸。NaOH調(diào)pH為7.2，搖瓶發(fā)酵需預先加入4 g/100 mL CaCO3以中和發(fā)酵過程產(chǎn)酸，115 ℃滅菌15 min。

1.4.3 搖瓶發(fā)酵

菌種活化：將凍存于–70 ℃的甘油管保藏菌株于固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)36 h。種子培養(yǎng)：利用接種環(huán)挑取活化好的新鮮菌苔，接種于裝有 25 mL種子培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。搖瓶發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液體按照初始OD562控制為1.0，接種入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，必要時添加30 μg/mL卡那霉素維持菌株抗性，同樣置于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。含有質(zhì)粒的重組菌株，在發(fā)酵進行到8 h時，添加1 mmol/L IPTG誘導重組載體上攜帶的基因進行表達。

1.4.4 5 L罐發(fā)酵

菌種活化和種子培養(yǎng)參照搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)200 mL種子液，接種入裝有2 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 發(fā)酵罐。發(fā)酵過程中，通過流加 50%的氨水的方式自動控制發(fā)酵培養(yǎng)基pH為7.2，通過夾套加熱控制溫度為30 ℃，通過發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速(200–800 r/min) 和通氣量(1.5 vvm) 的偶聯(lián)控制溶氧水平保持30%。發(fā)酵至8 h時，添加1 mmol/L IPTG誘導重組載體上攜帶的基因進行表達。當測得發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度低于20 g/L時，流加質(zhì)量濃度為80%的葡萄糖溶液，以保證菌株生長和產(chǎn)酸所必需的葡萄糖供應。每隔12 h取樣，發(fā)酵培養(yǎng)96 h。

1.5 發(fā)酵過程參數(shù)分析

發(fā)酵液中的葡萄糖濃度采用 SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所) 測定；發(fā)酵液菌體OD562采用紫外可見分光光度計(UV-1800，日本島津公司) 測定；基于細胞OD562與細胞干重(Dry cell weight，DCW) 的計算公式為：DCW=0.649 5×OD562–2.792 5，乘以稀釋倍數(shù)計算獲得[22]；L-纈氨酸、丙氨酸的含量通過高效液相色譜(Agilient Technoligies 1200 series，USA)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除alaT以降低胞內(nèi)雜酸

在前期的實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)，VWB-1在5 L發(fā)酵罐上的L-纈氨酸產(chǎn)量可以達到29.85 g/L，遠高于ATCC 13869的1.42 g/L。通過HPLC對VWB-1發(fā)酵液中的氨基酸含量進行分析發(fā)現(xiàn)，VWB-1發(fā)酵過程中主要雜酸為丙氨酸[16]。根據(jù)文獻報道，谷氨酸棒狀桿菌中存在兩條L-丙氨酸合成途徑[20](圖2)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AlaT和AvtA催化丙酮酸生產(chǎn) L-丙氨酸的氨基供體分別為 L-谷氨酸和L-纈氨酸。由AlaT催化下生成L-丙氨酸的途徑為細胞內(nèi)產(chǎn)生L-丙氨酸的主要途徑，由AvtA催化生成L-丙氨酸的途徑為次級途徑。為了研究谷氨酸棒狀桿菌中alaT在 L-纈氨酸和 L-丙氨酸合成中所起到的作用，我們對 VWB-1中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因alaT進行敲除，得到突變菌株VWB-2。以L-纈氨酸高產(chǎn)菌株VWB-1作為對照菌株，對菌株 VWB-2進行搖瓶發(fā)酵實驗，并檢測菌株的生長以及L-纈氨酸和L-丙氨酸合成情況(圖3)。

圖2 谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸合成代謝途徑Fig.2 The biosynthetic pathway of L-valine in C.glutamicum.

從圖3A中可以看出，alaT敲除后菌株的生長有輕微下調(diào)。如圖 3B所示，比較 VWB-1與VWB-2的 L-丙氨酸產(chǎn)生情況可以發(fā)現(xiàn)，alaT缺失菌株的L-丙氨酸產(chǎn)量出現(xiàn)大幅度的下調(diào)，同時L-纈氨酸產(chǎn)量有輕微的上調(diào)。由此表明，alaT的缺失能夠使谷氨酸棒狀桿菌L-丙氨酸合成能力大幅下降，但同時菌體仍有一定的丙氨酸合成能力，以保證細胞正常生長，這可能與細胞內(nèi)存在的另外一個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因avtA有關(guān)。由于丙氨酸途徑同時也是L-纈氨酸合成代謝的底物競爭途徑(圖 2)，兩條途徑有共同的關(guān)鍵底物丙酮酸。對谷棒細胞中的丙氨酸途徑進行阻斷，一方面有利于減少發(fā)酵液中丙氨酸含量，降低下游分離純化的成本，另一方面減少了L-纈氨酸途徑的碳代謝流損耗，對 L-纈氨酸合成有利，因此VWB-2可以作為L-纈氨酸代謝工程改造出發(fā)菌株。

2.2 ilvBN定點突變及其表達對谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-纈氨酸的影響

谷氨酸棒狀桿菌中的乙酰羥酸合酶(AHAS)是L-纈氨酸合成代謝中的關(guān)鍵酶，由2個亞基組成，分別是ilvB編碼的催化亞基IlvB和ilvN編碼的調(diào)節(jié)亞基IlvN[23]。AHAS同時也是細胞中3種支鏈氨基酸(L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸)合成的共用酶(圖2)，且受到這3種支鏈氨基酸的反饋抑制，ilvBN基因的表達受3種支鏈氨基酸的調(diào)控。在 L-纈氨酸生產(chǎn)中，乙酰羥酸合酶(AHAS) 是L-纈氨酸合成代謝中的關(guān)鍵酶。根據(jù)文獻報道，當乙酰羥酸合酶調(diào)節(jié)亞基IlvN 20–22位氨基酸由 Gly-Ile-Ile突變?yōu)?Asp-Asp-Phe時，能夠解除這 3種支鏈氨基酸對該酶的反饋抑制，從而有利 L-纈氨酸的生產(chǎn)[24]。為了比較來源于ATCC 13869和VWB-1的ilvBN點突變前后AHAS對在L-纈氨酸代謝中作用程度的不同，我們將不同來源的ilvBN連接到表達載體 pEC-XK99E上，構(gòu)建了重組載體 pEC-XK99E-ilvBN和 pECXK99E-ilvBN1，并以此為模板構(gòu)建了含有抗反饋抑制突變位點的重組載體 pEC-XK99E-ilvBNM13和pEC-XK99E-ilvBN1M13，從圖4中的測序結(jié)果可以看出，ilvN點突變構(gòu)建成功。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到 VWB-1中并進行搖瓶發(fā)酵，以比較不同的AHAS對菌株L-纈氨酸產(chǎn)量的影響(圖5)。如圖5A所示，ilvBN的表達對菌株生長均沒有影響，進入到對數(shù)生長后期以及穩(wěn)定期，含有重組質(zhì)粒的菌株對葡萄糖的消耗逐漸增加，這是因為ilvBN的表達促進細胞合成L-纈氨酸，對底物葡萄糖的需求能力加強。分析菌株發(fā)酵液中的L-纈氨酸含量，如圖5B所示，ATCC 13869和VWB-1來源的ilvBN的過量表達均能夠提高菌株的L-纈氨酸產(chǎn)量，而且在同等發(fā)酵條件下，表達含有突變位點M13的ilvBN基因的重組質(zhì)粒對菌株 L-纈氨酸產(chǎn)量的提升效果更為明顯。由此表明，IlvN 20–22位氨基酸的突變能夠更好地促進細胞代謝產(chǎn)L-纈氨酸，對L-纈氨酸生產(chǎn)有利。在之前的測序比對中，來源于 VWB-1的 AHAS與野生型AHAS相比存在9個氨基酸位點的突變，其中8個突變位點位于該酶催化亞基IlvB，分別為K30Q、G128S、A139V、H213R、A226S、Y252H、T362S、V562A，另外有一個突變位點 H47L位于調(diào)節(jié)亞基 IlvN[16]。相較于野生型來源的ilvBN和ilvBNM13，VWB-1來源的ilvBN1和ilvBN1M13的表達對L-纈氨酸產(chǎn)量提升的效果更為明顯，推測原因可能是由于AHAS活性中心存在的突變位點加強了該酶與底物的結(jié)合能力[24]，從而更利于發(fā)揮酶的催化功能。選用含有該重組質(zhì)粒的菌株VWB-1/pEC-XK99E-ilvBN1M13作為進一步代謝改造的出發(fā)菌株。

圖4 AHAS調(diào)節(jié)亞基編碼基因ilvN突變構(gòu)建測序結(jié)果Fig.4 The sequencing results of the mutated AHAS regulatory subunit coding gene ilvN.

2.3 L-纈氨酸主代謝通路強化

為了進一步提高菌株的L-纈氨酸生產(chǎn)能力，對L-纈氨酸合成代謝相關(guān)的一系列基因進行過量表達。谷氨酸棒狀桿菌中L-纈氨酸的合成途徑如圖 2所示，從丙酮酸出發(fā)，L-纈氨酸的合成代謝主要經(jīng)由乙酰羥酸合酶(AHAS)、乙酰羥酸同分異構(gòu)酶(AHAIR)、二羥酸脫水酶(DHAD) 和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TA) 四個主要酶的催化下完成。已經(jīng)有報道表明，相關(guān)基因的過量表達能夠提高谷氨酸棒狀桿菌的產(chǎn)L-纈氨酸水平[25-27]。本研究將 AHAIR編碼基因ilvC、DHAD的編碼基因ilvD、TA編碼基因ilvE通過酶切連接，串聯(lián)入載體 pEC-XK99E-ilvBN1M13，構(gòu)建得到 pECXK99E-ilvBN1M13CD和pEC-XK99E-ilvBN1M13CE，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入VWB-1中，進行搖瓶發(fā)酵實驗。結(jié)果如圖6所示，在消耗相同葡萄糖的情況下，菌株VWB-1/pEC-XK99E-ilvBN1M13C的L-纈氨酸產(chǎn)量達到了321.1 mmol/L，相較于VWB-1/pEC-XK99E(214.3 mmol/L) 提高了49.8%，而菌株VWB-1/pECXK99E-ilvBN1M13CD以及VWB-1/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE的L-纈氨酸產(chǎn)量則分別為353.4 mmol/L和370.5 mmol/L，相較于VWB-1/pEC-XK99E對比分別提高了64.9%和72.9%。由此證明，VWB-1 L-纈氨酸合成途徑關(guān)鍵基因ilvC、ilvD和ilvE的過量表達，均能夠有效地提高谷棒菌株產(chǎn)L-纈氨酸的能力。

圖5 抗反饋抑制AHAS的表達對L-纈氨酸產(chǎn)量影響(A：菌株生長；B：L-纈氨酸產(chǎn)量)Fig.5 Influence of the feedback resistant AHAS overexpression over the production of L-valine.(A) Growth curve and glucose consumption.(B) L-valine production level.

圖6 L-纈氨酸合成途徑和轉(zhuǎn)運途徑關(guān)鍵基因的表達對產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of the biosynthesis and transport related genes overexpression over the production of L-valine.(A)Growth curve and glucose consumption.(B) L-valine production level.

2.4 提升L-纈氨酸胞外轉(zhuǎn)運能力

細胞內(nèi) L-纈氨酸的積累會抑制相關(guān)酶的活性，對L-纈氨酸生產(chǎn)不利，因此L-纈氨酸在細胞體內(nèi)合成后需要迅速地分泌到細胞外。在谷氨酸棒狀桿菌中，負責L-纈氨酸胞外分泌的蛋白為分別由brnF和brnE編碼的膜轉(zhuǎn)運酶BrnF和BrnE，BrnFE同時也是細胞內(nèi)L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸的轉(zhuǎn)運蛋白，且brnFE的表達需要調(diào)控因子lrp的存在[28]。陳誠等在前期測序研究發(fā)現(xiàn)，VWB-1來源的lrp1基因編碼的Lrp1蛋白相比于 ATCC 13869來源的 Lrp有 1個點突變Arg39Trp，lrp和brnFE的共表達能夠促進細胞L-異亮氨酸、L-纈氨酸等的生產(chǎn)[21,29]。將來源于ATCC 13869和VWB-1的lrp1基因分別在VWB-1中進行表達，發(fā)現(xiàn)兩者均能提高細胞產(chǎn)L-纈氨酸的能力，且后者的作用更為明顯。另外，Lrp1的表達能促進細胞內(nèi)與 L-纈氨酸合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因ilvBC、ilvD、lrp和brnFE等的上調(diào)。為了提高細胞的 L-纈氨酸胞外運輸能力，我們以陳誠等[29]構(gòu)建的質(zhì)粒 pJYW-4-lrp1-brnFE為模板，擴增得到lrp1-brnFE，與前述構(gòu)建的重組載體pEC-XK99E-ilvBN1M13CD以及pEC-XK99E-ilvBN1M13CE進行串聯(lián)，構(gòu)建得到 pEC-XK99E-ilvBN1M13CD-lrp1-brnFE以及pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到 VWB-1中，進行搖瓶發(fā)酵實驗。圖6B是重組菌株產(chǎn)L-纈氨酸能力比較，可以看出，VWB-1/pEC-XK99E-ilvBN1M13CD-lrp1-brnFE以及 VWB-1/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE的 L-纈氨酸產(chǎn)量相較于沒有l(wèi)rp1-brnFE過表達菌株均有所提高，分別達到390.1 mmol/L和403.8 mmol/L，表明lrp1和brnFE的共表達能夠提高谷棒菌株的產(chǎn)L-纈氨酸水平。通過與lrp和brnF的啟動子的轉(zhuǎn)錄融合表達分析，3種支鏈氨基酸和L-甲硫氨酸刺激brnFE表達時需要調(diào)控因子Lrp的存在[28]。由于BrnFE負責細胞內(nèi)L-纈氨酸的胞外轉(zhuǎn)運，且Lrp1對brnFE的表達有正向的調(diào)控作用，因此，lrp1和brnFE的共表達能夠提高谷棒菌株VWB-1胞內(nèi)的BrnFE蛋白水平，從而提高細胞支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運能力。細胞內(nèi)合成的過量的L-纈氨酸被BrnFE大量的轉(zhuǎn)移到胞外，同時加快了L-纈氨酸的合成速度，從而更有利于L-纈氨酸生產(chǎn)。

2.5 L-纈氨酸合成及轉(zhuǎn)運途徑相關(guān)基因的共表達以提高L-纈氨酸產(chǎn)量

作者通過基因敲除獲得了 VWB-1的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因alaT的敲除突變株VWB-2，降低雜酸丙氨酸生成的同時減少了丙氨酸途徑對L-纈氨酸合成底物丙酮酸的競爭。并且通過構(gòu)建重組質(zhì)粒的方式，將細胞中參與L-纈氨酸代謝合成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因進行過量表達，顯著提高了細胞了L-纈氨酸合成能力和轉(zhuǎn)運水平。為了更好地提高細胞產(chǎn)L-纈氨酸的水平，同時降低雜酸丙氨酸的含量，我們將對L-纈氨酸產(chǎn)量提高作用最為顯著的質(zhì)粒 pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE轉(zhuǎn)入到VWB-2中，構(gòu)建得到VWB-2/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE。搖瓶水平發(fā)酵表明，上述菌株的L-纈氨酸產(chǎn)量相較于VWB-1/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE有進一步提高，且菌株發(fā)酵液中的雜酸丙氨酸含量由 30.5 mmol/L下降為5.3 mmol/L，降幅達到82.6%。進一步對該菌株進行5 L罐發(fā)酵實驗，檢測菌株在發(fā)酵過程中各個時期的生長特性、糖耗水平以及產(chǎn)L-纈氨酸能力。如圖7所示，當發(fā)酵進行到60 h時，由于葡萄糖即將耗盡，因此進行糖液的補充，提供碳源以使菌株繼續(xù)生長和產(chǎn)酸。發(fā)酵96 h后，菌株的細胞干重達到47.2 g/L，L-纈氨酸產(chǎn)量達到461.4 mmol/L，相較于原始菌株提高了115.3%，產(chǎn)率 0.564 g/(L·h)，比產(chǎn)量 1.162 g/(L·g DCW)，糖酸轉(zhuǎn)化率達到0.312 g/g葡萄糖。當發(fā)酵進入到96 h時，菌株仍然維持比較高的生長和耗糖狀態(tài)，且產(chǎn)L-纈氨酸水平仍有上升趨勢?？紤]到發(fā)酵周期過度延長可能降低整個發(fā)酵過程的產(chǎn)物得率，所以可選擇在 96 h時結(jié)束發(fā)酵。當然，該菌株產(chǎn) L-纈氨酸的水平仍有望進一步提高，后期可以進行更深入的代謝工程改造，并對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及發(fā)酵策略進行優(yōu)化，進一步提高菌株產(chǎn)量。

圖7 5 L罐水平檢測菌株生長及生產(chǎn)性能Fig.7 Growth and L-valine production performance detection of the recombinant strain in 5 L fermentator.

3 討論

作為一種重要的支鏈氨基酸，L-纈氨酸的工業(yè)生產(chǎn)一直備受關(guān)注。目前，微生物發(fā)酵法正取代直接提取法和化學合成法而成為L-纈氨酸生產(chǎn)的主要方法。但是許多工業(yè)上應用的L-纈氨酸生產(chǎn)菌株為多次誘變篩選獲得，帶來的二次有害突變會導致菌株生長緩慢、糖耗降低、雜酸等副產(chǎn)物增多，具有盲目性和不確定性。因此，合理、高效的設(shè)計在谷氨酸棒狀桿菌代謝工程改造中便顯得尤為重要，生產(chǎn)菌株不僅應該有較高的L-纈氨酸生產(chǎn)能力，還要有最少化的副產(chǎn)物積累，從而簡化隨后的分離和純化過程，減少生產(chǎn)成本。例如，溶氧速率對生物反應過程有較大影響，進行菌株改造的時候，需要對此加以考慮[30]。微生物分子生物學的發(fā)展使人們重新認識了L-纈氨酸生產(chǎn)菌株，DNA重組技術(shù)和誘導技術(shù)的出現(xiàn)促使代謝工程取代傳統(tǒng)育種成為主流的菌株改造策略。近年來，利用創(chuàng)新的基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究人員可以在谷氨酸棒狀桿菌中快速高效地進行基因編輯，包括基因敲除、插入和替換等，為代謝途徑的改造提供了有力的工具，以此促進谷氨酸棒狀桿菌的代謝工程育種進程[31-33]。深入了解L-纈氨酸生物合成的代謝和調(diào)節(jié)機制對谷氨酸棒狀桿菌整體代謝工程策略的設(shè)計至關(guān)重要，未來的研究需要更多的關(guān)注谷氨酸棒狀桿菌細胞的代謝網(wǎng)絡(luò)。隨著系統(tǒng)生物學和合成生物學技術(shù)的快速發(fā)展，合理利用轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學、代謝組學和計算機建模等現(xiàn)代生物技術(shù)，解析L-纈氨酸生產(chǎn)菌株繁雜的合成代謝途徑以及多重的調(diào)控機制，由點到面、從局部到整體對生產(chǎn)菌株進行改造，提升生產(chǎn)性能[3,34]。

本研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因alaT的缺失能夠降低 L-纈氨酸生產(chǎn)菌株發(fā)酵液丙氨酸的含量，以此削弱細胞內(nèi)丙氨酸途徑對 L-纈氨酸代謝途徑關(guān)鍵前體丙酮酸的競爭，同時降低下游分離純化的成本。Wada等[35]敲除了 L-纈氨酸生產(chǎn)菌株 ATCC13032ΔilvAΔpanBCpJC1ilvBNCD中的alaT基因，同樣極大地降低了細胞內(nèi)L-丙氨酸的積累。串聯(lián)表達L-纈氨酸合成途徑關(guān)鍵基因ilvBN1M13、ilvC、ilvD、ilvE，能夠?qū)⒓毎麅?nèi)的碳代謝流引入L-纈氨酸途徑，在L-纈氨酸生產(chǎn)菌株代謝改造中非常關(guān)鍵[36]。在減少副產(chǎn)物、加強主通路碳代謝流的基礎(chǔ)上，本研究在谷氨酸棒狀桿菌中過表達L-纈氨酸轉(zhuǎn)運途徑相關(guān)基因brnFE及其調(diào)控蛋白lrp1，能夠顯著提高細胞產(chǎn)L-纈氨酸的能力及其轉(zhuǎn)運能力，從而提高菌株L-纈氨酸產(chǎn)量。Chen等[21]在ATCC 13869過表達lrp1-brnFE，同樣提高了菌株的 L-纈氨酸生產(chǎn)性能。對菌株 VWB-2/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE進行補料分批發(fā)酵實驗，發(fā)酵96 h時L-纈氨酸產(chǎn)量達到461.4 mmol/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達到0.312 g/g葡萄糖，使L-纈氨酸產(chǎn)量相較于原始菌株大幅度提高，同時菌株發(fā)酵液中的雜酸液降到較低的水平。通過與已經(jīng)報道的L-纈氨酸高產(chǎn)菌株進行比較，該菌株L-纈氨酸產(chǎn)量處于中游水平，仍有較大提升空間[37]。另外，本研究構(gòu)建的重組菌株均通過導入外源質(zhì)粒的方法來提高關(guān)鍵基因的表達水平，后期還可以通過染色體重組技術(shù)，例如將野生型基因進行突變使其能夠抗支鏈氨基酸反饋抑制、增加重要基因在染色體上的拷貝數(shù)、加強野生型啟動子的活性等，進一步提高菌株生產(chǎn)性能。

致謝：感謝 Institute of Biotechnology(Forschungszentrum Julich) Lothar Eggeling教授為本研究提供alaT的敲除載體pK19mobsacBalaT。