汪城墻，李洪興，徐麗麗，沈煜，侯進，鮑曉明

1 齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353

2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東 泰安 271018

3 山東大學(xué) 生命學(xué)院 微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 濟南 250100

以地球上儲量最豐富的可再生資源木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料，生產(chǎn)環(huán)境友好的能源及化工化學(xué)品等生物基產(chǎn)品，能有效緩解石油等化石資源的消耗，降低對化石資源的依賴，對人類可持續(xù)發(fā)展有重要的積極意義。以秸稈類及相關(guān)工業(yè)棄物等生物質(zhì)資源為原料生產(chǎn)二代燃料乙醇是生物質(zhì)利用的有效途徑之一。木質(zhì)纖維素含有大量的六碳糖(主要是葡萄糖) 及五碳糖(主要是木糖和L-阿拉伯糖)，完全水解后得到的總糖含量與淀粉質(zhì)原料接近，而充分利用這些糖分是實現(xiàn)經(jīng)濟盈利二代燃料乙醇生產(chǎn)的重要因素[1-4]。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵微生物，具有利用己糖快速生長、發(fā)酵能力強、乙醇產(chǎn)率高、對乙醇等抑制物耐受性高及食品級安全性等優(yōu)良生產(chǎn)性能。對多種糖分的高效共發(fā)酵是精準構(gòu)制適于二代燃料乙醇生產(chǎn)釀酒酵母需要解決主要的瓶頸之一。利用代謝工程和合成生物學(xué)策略，包括本課題組在內(nèi)的全球科學(xué)家對二代燃料乙醇專用釀酒酵母的精準構(gòu)制已持續(xù)研究了30余年，主要通過理性改造(強化或弱化) 有效分子元件及非理性定向進化等措施，目前已極大地提高了釀酒酵母木糖/葡萄糖的共發(fā)酵能力，基本達到產(chǎn)業(yè)化要求[5-17]。其中，糖轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)是近年來較為關(guān)注的有效分子元件理性改造節(jié)點，目前糖轉(zhuǎn)運蛋白已逐漸接近二代乙醇生產(chǎn)特種釀酒酵母所希望的糖轉(zhuǎn)運理想狀態(tài)，即不同糖分各行其道、高效專一性的轉(zhuǎn)運蛋白各行其責(zé)，最大限度解除葡萄糖在轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)對五碳糖轉(zhuǎn)運的阻遏，提高糖醇轉(zhuǎn)化率，并揭示了部分重要的轉(zhuǎn)運調(diào)控分子機制[18]。同時相對滯后的葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖3種糖共發(fā)酵的釀酒酵母代謝工程研究也取得了階段性結(jié)果[19]。本文綜述了近年來木糖和L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運，及三糖共發(fā)酵的研究進展，并分析釀酒酵母木糖代謝工程研究現(xiàn)狀，為在工業(yè)領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供參考。

1 釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運的研究進展

根據(jù)代謝工程理念，通過引入釀酒酵母缺乏的戊糖代謝上游途徑，可以賦予釀酒酵母利用木糖或(和) L-阿拉伯糖的能力，但效率往往不高，雖然提高下游代謝流量正向關(guān)聯(lián)戊糖的代謝效率[10,19-20]，但糖轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)也必定是主要的限制因素[21]。一般地，釀酒酵母代謝工程菌通過內(nèi)源性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白非特異性地執(zhí)行對木糖或(和)L-阿拉伯糖的跨膜運輸，這一過程受到葡萄糖的強烈抑制，局限了戊糖的轉(zhuǎn)運效率，從而降低了糖的共利用效率[22-28]。因此，提高糖轉(zhuǎn)運蛋白對戊糖的親和力，甚至專一性轉(zhuǎn)運戊糖而不受葡萄糖的抑制，是急需在二代燃料乙醇專用釀酒酵母中建立的特定性能。

1.1 戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的類型及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

微生物中的單糖轉(zhuǎn)運蛋白可分成三大類：易化超家族轉(zhuǎn)運蛋白(Major facilitator superfamily，MFS)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette，ABC) 和磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運蛋白(Carbohydrate phosphotransferase system，PTS)[22]。其中MFS型轉(zhuǎn)運蛋白又分為兩類，即：不消耗能量且借助糖濃度梯度的單向異化擴散型(Facilitator/Uniporter) 被動運輸；不依賴糖濃度梯度、但需偶聯(lián)質(zhì)子濃度消耗ATP能量的質(zhì)子同向協(xié)同型(H+-linked symporter) 主動運輸[28-29]。研究表明釀酒酵母內(nèi)源非特異性轉(zhuǎn)運戊糖的轉(zhuǎn)運蛋白均屬于不消耗能量的單向異化擴散型[30-31]。

由于膜蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，其晶體結(jié)構(gòu)不易得到。截至目前，尚未解析在釀酒酵母中表達的戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的具體晶體結(jié)構(gòu)，但通過同源建模策略，可推測其結(jié)構(gòu)[26,32-33]，為研究戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機制和分子動力學(xué)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2012年，第一個戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)被解析，即大腸桿菌Escherichia coli中的質(zhì)子同向協(xié)同型木糖轉(zhuǎn)運蛋白XylEp。隨后解析了胞外半開放[34]、胞內(nèi)半開放和胞內(nèi)開放[35-36]的構(gòu)象。但在釀酒酵母中尚不能功能性表達[37]。2014年，人源葡萄糖單向轉(zhuǎn)運蛋白 GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)得以解析[38]。上述晶體結(jié)構(gòu)為釀酒酵母源戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)分析提供了技術(shù)支持和參考模型。釀酒酵母中表達的戊糖轉(zhuǎn)運蛋白(圖 1)，一般由 12個跨膜區(qū)(即12個 α螺旋) 圍繞構(gòu)成一個孔道，分為2個各含6個α螺旋的結(jié)構(gòu)域(N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域)，N和 C末端存在于細胞內(nèi)[39]，是典型的MFS轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)特征。

1.2 釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究方法

圖1 釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structural diagram of pentose transporters in S.cerevisiae.

戊糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運能力的分析需要借助于有效可行的研究方法，常用于釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運蛋白功能研究的方法有3種。其一，將轉(zhuǎn)運蛋白表達在不含戊糖初始代謝途徑的釀酒酵母菌株中，直接將菌株在H3或C14同位素標記的戊糖中短時間孵育，測定胞內(nèi)放射性的強弱直接得到戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運能力[40]，但放射性對細胞自身的損傷導(dǎo)致孵育時間不宜過長，并對操作平臺設(shè)施要求較高。其二，同樣將不含戊糖初始代謝途徑的釀酒酵母菌株，分別較長時間孵育在戊糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，收集細胞后，通過低滲等方式釋放胞內(nèi)積累的戊糖，測得的戊糖濃度即為木糖的積累量，并以此表征轉(zhuǎn)運蛋白的戊糖轉(zhuǎn)運能力[26,29]。由于細胞內(nèi)非特異性醛糖還原酶的作用，對應(yīng)的還原產(chǎn)物戊糖醇也一并計算為胞內(nèi)的戊糖積累量。其三，在釀酒酵母中引入戊糖初始代謝途徑，并在含有戊糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定菌株對戊糖的消耗及生長，間接推斷其戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運能力[26,37,41]。

但是上述方法都不便于戊糖轉(zhuǎn)運蛋白性能的高通量定量篩選。本課題組建立了一個基于化學(xué)發(fā)光強度檢測木糖運能力的新方法。其基本原理是在釀酒酵母細胞中表達有木糖苷酶(Xylosidase)，在證明該木糖苷酶主要表達在細胞內(nèi)的前提下，利用該酶可以水解木糖類似物對硝基酚木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX) 產(chǎn)生黃色的對硝基酚(p-nitrophenol，pNP)，且該物質(zhì)具有可以自由出入細胞的特點，通過檢測細胞外化學(xué)發(fā)光的強度變化以表征木糖轉(zhuǎn)運能力。該方法是高通量的間接篩選木糖轉(zhuǎn)運蛋白的方法[24]。另外，通過構(gòu)建木糖濃度感應(yīng)的傳感器系統(tǒng)，也是木糖轉(zhuǎn)運蛋白的高通量篩選方法[42-43]，其基本原理是在細胞內(nèi)組成型表達異源阻遏蛋白XylR，其功能活性因與木糖結(jié)合與否而改變；同時將綠色熒光蛋白yEGFP置于受該阻遏蛋白調(diào)控的啟動子下。胞內(nèi)木糖量不足時，XylR抑制yEGFP的表達，但隨著細胞內(nèi)木糖攝入量的增加，結(jié)合木糖的 XylR便促進綠色熒光蛋白的表達。因此，通過木糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)入細胞的木糖越多，綠色熒光強度越大，通過簡單的熒光檢測就可以高通量篩選木糖轉(zhuǎn)運蛋白突變子。

1.3 釀酒酵母木糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究

1.3.1 釀酒酵母中木糖轉(zhuǎn)運蛋白功能表達研究

野生型釀酒酵母可利用自身己糖轉(zhuǎn)運蛋白非特異性地攝取木糖。早期德國法蘭克福大學(xué)Boles教授利用構(gòu)建的釀酒酵母的內(nèi)源 18個己糖轉(zhuǎn)運蛋白全敲除菌株(hxt null，EBY.VW4000)[44]，通過質(zhì)粒導(dǎo)入，逐一分析了這些轉(zhuǎn)運蛋白對木糖的轉(zhuǎn)運能力，表明內(nèi)源性轉(zhuǎn)運木糖的蛋白主要是Hxt1p、Hxt2p、Hxt4p、Hxt5p、Hxt11p、Hxt7p和Gal2p。其中，Hxt7p和Gal2p對木糖的轉(zhuǎn)運效率較高。但這些轉(zhuǎn)運蛋白對木糖的親和力遠低于對葡萄糖的，并受到葡萄糖的強烈抑制，進而限制了重組酵母對木糖的利用[25,30,37,44-48]。

將天然能利用木糖微生物的高木糖親和力轉(zhuǎn)運蛋白異源表達在釀酒酵母中也是提高其木糖攝取效率的熱門研究內(nèi)容。到目前為止，源于瑞氏木霉Trichoderma reesei、間型假絲酵母Candida intermedia、新型隱球菌Cryptococcus neoformans、漢遜德巴利酵母Debaryomyces hansenii、樹干畢赤酵母Scheffersomyces stipitis、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica、粗糙脈孢菌Neurospora crassa、馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus、季也蒙畢赤酵母Pichia guilliermondii和季也蒙酵母Meyerozyma guilliermondii等真核生物及擬南芥Arabidopsis thaliana的木糖轉(zhuǎn)運蛋白已在釀酒酵母中異源表達[26,29,41,49-50]。某些轉(zhuǎn)運蛋白在一定條件下可以促進釀酒酵母對木糖的轉(zhuǎn)運和利用能力，例如，C.intermedia的Gxf1p、S.stipitis的Sut1p和A.thaliana的 At5g59250p、At5g17010p等在野生型釀酒酵母中表達后一定程度提高了菌株在木糖上的生長能力和代謝能力[48,51-53]。而本課題組在對季也蒙酵母M.guilliermondii的研究中發(fā)現(xiàn)了兩類糖轉(zhuǎn)運蛋白：消耗能量的質(zhì)子同向協(xié)同型的轉(zhuǎn)運蛋白 Mgt05860p，胞內(nèi)木糖積累量較高，但卻不能促進菌株在木糖上的生長能力；而不消耗能量的單向異化擴散型轉(zhuǎn)運蛋白Mgt05196p，雖然胞內(nèi)木糖積累量較低，但能較好地促進木糖利用[26]。尚未有細菌源木糖轉(zhuǎn)運蛋白在釀酒酵母中有效表達的研究。

釀酒酵母的內(nèi)源己糖轉(zhuǎn)運蛋白全敲除菌株(hxt null，EBY.VW4000)[44]和主要己糖轉(zhuǎn)運蛋白HXT1-7p與Gal2p的缺失菌株[54]是分析具體單個木糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運能力的有效工具菌。通過上述1.2介紹的第 3種釀酒酵母戊糖轉(zhuǎn)運蛋白研究方法，即胞內(nèi)戊糖積累量，或引入木糖初始代謝途徑并通過生長表型來分析轉(zhuǎn)運蛋白的木糖轉(zhuǎn)運能力。例如：T.reesei的TrXlt1p和Stp1p，K.marxianus的 KmAXT1p，P.guilliermondii的 PgAXT1p，M.guilliermondii的 Mgt05196p、Mgt05293p和Mgt04891p，C.intermedia的 Gxf1p和 Gxs1p，D.hansenii的 XylHPp和 2D01474p，S.stipitis的RGT2p、Xut1p和 Xut3p等的導(dǎo)入，均能使含有木糖初始代謝途徑但己糖轉(zhuǎn)運蛋白全敲除(hxt null) 的釀酒酵母菌株利用木糖生長[26,30,37,49-50]。N.crassa和S.stipitis中分別克隆得到的轉(zhuǎn)運蛋白An25p和Xyp29p[29]，以及季也蒙酵母M.guilliermondii的Mgt05860p[26]，雖然不能使菌株在木糖上生長，但可以表現(xiàn)出顯著的木糖胞內(nèi)積累量特征，也證明了木糖轉(zhuǎn)運能力。

1.3.2 釀酒酵母木糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能位點分析與分子改造研究

木糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運活性往往取決于某些保守序列和關(guān)鍵氨基酸位點，個別氨基酸的點突變就可以顯著影響轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運效率和轉(zhuǎn)運偏好性。目前已分析得到了木糖轉(zhuǎn)運蛋白的部分重要功能位點，并且一些木糖轉(zhuǎn)運能力提高的正突變子也證明有利于木糖的利用[25-26,34,42,49,55-57]。

糖轉(zhuǎn)運蛋白的保守序列“G-G/F-XXX-G”和“YFFYY”對木糖轉(zhuǎn)運起到關(guān)鍵作用。Young等[23]首次分析了木糖轉(zhuǎn)運活性位點，并對在釀酒酵母中異源表達的 46個木糖轉(zhuǎn)運蛋白的序列分析后發(fā)現(xiàn)了第一跨膜區(qū)(TMS1) 上的保守序列“G-G/F-XXX-G”，通過對這一區(qū)域的氨基酸點突變，C.intermedia來源的突變子Gxs1V38F-L39I-F40M、S.stipitis來源的突變子Rgt2I38F-F40M和S.cerevisiae來源的突變子 Hxt7V39I-F40M-D340M均由葡萄糖木糖共轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋赞D(zhuǎn)運木糖(表1)，但仍舊受到葡萄糖的抑制。本課題組通過對源于季也蒙酵母M.guilliermondii轉(zhuǎn)運蛋白Mgt5196p的研究，發(fā)現(xiàn)了另一個存在于 TMS7上的保守序列“YFFYY”，對每一個位點進行Ala失活突變后均顯著降低轉(zhuǎn)運蛋白對木糖的轉(zhuǎn)運效率，可見此芳香族氨基酸富集區(qū)域?qū)δ咎寝D(zhuǎn)運的活性至關(guān)重要[26]。

葡萄糖的存在會抑制木糖的利用，而在糖轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)就存在這種抑制作用。篩選解除葡萄糖抑制的木糖特異性轉(zhuǎn)運蛋白突變子，對提高釀酒酵母的混糖共代謝速率意義重大。通過分子改造，目前已獲得了一些緩解或解除葡萄糖抑制的木糖特異性轉(zhuǎn)運蛋白突變子。表1顯示、C.intermedia來源的突變子 Gxs1-FIVFH497*[58]、N.crassa來源的突變子AN25-R4.18[33]以及S.cerevisiae內(nèi)源的突變子Hxt11-N366 mutants[25]，均可以有效緩解葡萄糖對轉(zhuǎn)運蛋白木糖轉(zhuǎn)運活性的抑制，而釀酒酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)運蛋白的點突變子 Gal2N376F和Hxt36N367F，以及本課題組得到的源于季也蒙酵母M.guilliermondii轉(zhuǎn)運蛋白突變子Mgt05196N360F，則是完全解除葡萄糖抑制的木糖專一性轉(zhuǎn)運蛋白突變子[26,32,55]。這些突變子不僅是單糖特異性轉(zhuǎn)運機制研究的重要素材，也是釀酒酵母工業(yè)菌株精準構(gòu)制的重要有效元件。本課題組在釀酒酵母木糖利用工業(yè)菌株中表達了源于季也蒙酵母M.guilliermondii轉(zhuǎn)運蛋白突變子Mgt05196N360F，并輔助定向馴化育種措施，使轉(zhuǎn)運蛋白帶來的木糖代謝能力提高了0.91倍[15]，進一步提高了菌株的產(chǎn)業(yè)化性能。

表1 釀酒酵母中高活性表達的木糖特異性轉(zhuǎn)運蛋白突變子Table 1 Highly-active and specific xylose tranporter mutants in S.cerevisiae

1.4 釀酒酵母L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究

野生型釀酒酵母可以通過內(nèi)源的己糖運輸?shù)鞍譍al2p、Hxt9p和Hxt10p攝取L-阿拉伯糖[59]，其中，對 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運活性最高的是 Gal2p。Wisselink等[60]通過敲除GAL2基因，使菌株喪失在L-阿拉伯糖上的生長能力，從另一角度證明了Gal2p的轉(zhuǎn)運功能對釀酒酵母利用 L-阿拉伯糖的積極意義。Becker等[61]和本課題組[19,28]在釀酒酵母中超表達了內(nèi)源的GAL2基因后增強了菌株對L-阿拉伯糖的吸收能力和代謝能力。

異源表達L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白可以緩解葡萄糖的阻遏，有效提高釀酒酵母代謝 L-阿拉伯糖的能力。迄今為止，人們已在多種天然L-阿拉伯糖代謝菌株當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了多個 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白[31,62]，有效促進了L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運功能的研究。最早，Verho等[63]從單孢蟲道酵母Ambrosiozyma monospora中得到了2個可提高釀酒酵母L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運能力的L-阿拉伯糖專一性轉(zhuǎn)運蛋白。隨后，天然可利用L-阿拉伯糖的真菌中來源的多個糖轉(zhuǎn)運蛋白，在釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運蛋白敲除菌株(hxt null，EBY.VW4000)[44]中均表現(xiàn)出 L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運能力，它們是S.stipitis的 AraTp、A.thaliana的 Stp2p、K.marxianus的 KmAXT1p、P.guilliermondii的 PgAXT1p、Mgt05860p、Mgt05293p和 Mgt04891p、N.crassa的 LAT-1、皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum的 Tct1p、T.reesei的 Stp1p和嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila的 MtLAT-1[26,50,59,62]。

L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能位點研究相對較少。工具菌株的缺乏是限制因素之一。本課題組構(gòu)建了可用于分析L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白及其功能位點并方便使用的工具菌株。在前期構(gòu)建的可以高效利用 L-阿拉伯糖的菌株 BSW3AP[28]的基礎(chǔ)上，敲除基因組上的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白Gal2p，使菌株失去利用L-阿拉伯糖的能力，進而通過質(zhì)粒引入糖轉(zhuǎn)運蛋白，即可基于菌株在以L-阿拉伯糖為唯一碳源上的生長狀態(tài)研究轉(zhuǎn)運蛋白的功能。我們的研究結(jié)果表明，Gal2p的第一跨膜區(qū)上的保守區(qū)域“G-G/F-XXX-G”也是轉(zhuǎn)運L-阿拉伯糖的重要區(qū)域，突變子Gal2p(F85S) 可以顯著提高L-阿拉伯糖和木糖轉(zhuǎn)運效率，并可以緩解葡萄糖轉(zhuǎn)運抑制[64]。

2 釀酒酵母戊糖及混合糖代謝工程的研究

2.1 釀酒酵母的木糖代謝工程的研究

木質(zhì)纖維素的全糖乙醇高效共轉(zhuǎn)化是提高以木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料二代燃料乙醇生產(chǎn)經(jīng)濟性的一個必要措施。雖然對傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌釀酒酵母S.cerevisiae而言，需要解決葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖共利用的問題，但目前主要研究進展集中在葡萄糖/木糖的乙醇共發(fā)酵上。30多年來，釀酒酵母的木糖代謝工程研究歷程可歸納成 4個環(huán)節(jié)：①高效異源木糖利用途徑的建立。釀酒酵母主要是缺乏轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的上游代謝途徑而不能代謝木糖。由木糖還原酶(Xylose reductase，XR) 與木糖醇脫氫酶(Xylitol dehydrogenase，XDH) 構(gòu)成XR-XDH途徑，是較早在釀酒酵母中建立的木糖代謝途徑，但因為這對還原/氧化酶所依賴的輔酶因子偏好性不同，容易造成細胞內(nèi)氧化還原不平衡，造成大量木糖醇等中間產(chǎn)物的積累，難以提高糖醇轉(zhuǎn)化率。雖然開展了大量輔酶工程的研究，但這一缺陷始終沒能有效克服[9-10,65-67]。而無需輔酶且一步完成木糖到木酮糖轉(zhuǎn)化的短程木糖異構(gòu)酶XI(Xylose isomerase) 途徑，普遍認為是搭建釀酒酵母木糖代謝途徑的首選策略，但能在釀酒酵母中高活性表達的木糖異構(gòu)酶基因的篩選卻經(jīng)歷了十分艱苦的過程，直到 2003年才報道了第一例[6]，隨后，包括本課題組在內(nèi)又陸續(xù)報道了幾例[68-71]。雖然上述建立了初始木糖代謝途徑的重組菌株可以利用木糖，但效率不高。②內(nèi)源性代謝節(jié)點的理性改造。木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，再經(jīng)過磷酸戊糖途徑(Pentose phosphatepathway，PPP) 進入乙醇發(fā)酵主代謝途徑。本環(huán)節(jié)主要包括理性強化內(nèi)源下游途徑，弱化旁支途徑及能源消耗節(jié)點等[10,17,69-70,72]。近年來，理性改造的關(guān)注點偏移到糖轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)，釀酒酵母中葡萄糖對木糖的轉(zhuǎn)運有明顯的阻遏作用，適于二代燃料乙醇生產(chǎn)釀酒酵母糖轉(zhuǎn)運的理想狀態(tài)是木糖/葡萄糖各行其道、高效專一性轉(zhuǎn)運蛋白各行其責(zé)，本文已對相關(guān)研究進展進行了總結(jié)。③進化工程的非理性改造。由于木糖代謝及木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程產(chǎn)生的抑制物的復(fù)雜性，及人們對相關(guān)生物學(xué)過程理論認識依然不足，因而，菌株在木糖或脅迫條件下進行長期適應(yīng)性進化并篩選，是進一步提高木糖代謝能力及抑制物耐受力普遍使用的有效措施，且不乏有成功的例子[10-11,13,15,73]。④木糖/葡萄糖共代謝魯棒性釀酒酵母工業(yè)菌株的構(gòu)建。釀酒酵母單倍體營養(yǎng)缺陷型菌株易于得到研究結(jié)果，但不適于粗放條件的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程，因此，需要將上述研究結(jié)果引入到魯棒性較強的釀酒酵母工業(yè)菌株底盤細胞中，目前所得到的重組菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液，糖醇轉(zhuǎn)化率在0.40-0.48 g/g(Total sugar) 之間[13-15,74]。其中本課題組通過綜合評估選擇出魯棒性強且本底木糖代謝能力較高的二倍體野生型釀酒酵母菌株為底盤細胞，并基于兩個獨特的重要元件——能在釀酒酵母中高效表達的木糖異構(gòu)酶 Ru-XI(編碼基因Ru-xylA源于牛瘤胃宏基因組，ZL 201110042170.2，US 8,586,336 B2，EP 2679686) 及不受葡萄糖阻遏的木糖專一性轉(zhuǎn)運蛋白 Mgt05196pN360F，對底盤細胞進行一系列理性及非理性改造，最終得到一株高效同步共發(fā)酵木糖/葡萄糖釀酒酵母工程菌株LF1。其對混合糖發(fā)酵時，約16 h即可耗盡培養(yǎng)基中全部葡萄糖和 94.5%木糖，乙醇得率達到理論得率的93%以上。更可喜的是該菌株表現(xiàn)出很好的木糖/葡萄糖同步共發(fā)酵的能力，在葡萄糖耗盡(約12 h) 時，木糖的消耗為77.6%。在兩種木質(zhì)纖維素預(yù)處理水解液(稀酸預(yù)處理的玉米秸稈水解液 SECS和亞硫酸鹽預(yù)處理的小麥秸稈造紙殘渣SPPR) 中也具有優(yōu)良的發(fā)酵能力。為降低生產(chǎn)成本，以尿素為氮源寡營養(yǎng)的條件下，在SPPR中，18 h內(nèi)菌株即可耗盡全部木糖，在SECS中，約40 h消耗90%以上的木糖，乙醇得率均達到理論乙醇得率的80%以上[15,75]。

2.2 釀酒酵母L-阿拉伯糖代謝工程的研究

相對于木糖代謝工程，釀酒酵母L-阿拉伯糖途徑精準構(gòu)制的研究相對滯后。同樣地，天然釀酒酵母沒有L-阿拉伯糖的初始代謝途徑，需要將其他微生物中存在的L-阿拉伯糖初始代謝途徑引入釀酒酵母中，以在釀酒酵母中建立L-阿拉伯糖代謝途徑。

L-阿拉伯糖通過 5-磷酸木酮糖中間產(chǎn)物進入主代謝，微生物中完成這一過程的主要途徑有兩條[76]。真菌中是需要5個酶的復(fù)雜途徑[77]，即L-阿拉伯糖還原酶(Arabinose reductase，AR)、L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(L-arabinitol 4-dehydrogenase，LAD)、L-木酮糖還原酶(L-xylulose reductase，LXR)、木糖醇脫氫酶(D-xylitol dehydrogenase，XDH) 和木酮糖激酶(Xylulokinase，XK)，其中包括4個氧化還原反應(yīng)，容易造成氧化還原不平衡[77-78]。而細菌中L-阿拉伯糖初始代謝途徑是通過3個酶完成，即L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase，AI)、L-核酮糖激酶(L-ribulokinase，RK) 和 L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(L-ribulose-5-P-4-epimerase，RPE)。其中 AI的活性是在釀酒酵母中建立L-阿拉伯糖代謝途徑的關(guān)鍵節(jié)點[61]。為此，本課題組[28]進一步通過提高L-阿拉伯糖異構(gòu)酶AI基因的拷貝數(shù)、強化磷酸戊糖途徑、超表達內(nèi)源性對L-阿拉伯糖親和力較高的轉(zhuǎn)運蛋白 Gal2p，并結(jié)合 L-阿拉伯糖為唯一碳源的適應(yīng)性進化等策略，顯著提高了釀酒酵母菌株L-阿拉伯糖的代謝能力，L-阿拉伯糖最大比消耗速率達到 0.61 g/(h?g DCW)(Dry cell weight)。

2.3 釀酒酵母三糖共代謝菌株的構(gòu)建

充分利用木質(zhì)纖維素原料，需要在釀酒酵母中構(gòu)建葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖共發(fā)酵菌株，以拓展釀酒酵母底物利用范圍，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素原料的全糖轉(zhuǎn)化。但目前關(guān)于三糖共發(fā)酵釀酒酵母工程菌株構(gòu)建的報道并不多，而多半是在實驗室菌株中完成，且糖醇轉(zhuǎn)化效率較低。

由于真菌的L-阿拉伯糖初始代謝途徑中包括了木糖的 XR-XDH初始代謝途徑，Bettiga等[77]在釀酒酵母中引入該途徑，使其可以利用三糖，但對木糖和L-阿拉伯糖的利用率很低。葡萄糖耗盡后，菌株對木糖和L-阿拉伯糖的比消耗速率分別為 0.08 g/(h·g DCW) 和 0.02 g/(h·g DCW)，乙醇得率達到0.35 g/(g Pentose)，僅為理論值的68%。相反，Bera等[79]是在含有木糖 XR-XDH代謝途徑的釀酒酵母菌株中，又表達了L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(LAD) 和 L-木酮糖還原酶(ALK)，也得到了共利用三糖的菌株。Karhumaa等[80]和Sanchez等[81]將細菌 L-阿拉伯糖初始代謝途徑和木糖XR-XDH初始代謝途徑同時引入釀酒酵母，菌株也可以利用三糖，但木糖還原酶(XR) 減少了L-阿拉伯糖向乙醇代謝的流向，而增加副產(chǎn)物L(fēng)-阿拉伯糖醇的產(chǎn)生。為了緩解細菌L-阿拉伯糖初始代謝途徑受XR的影響，Wisselink等[82]將細菌L-阿拉伯糖初始代謝途徑和木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase，XI) 共表達，舍棄容易產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化還原途徑(XR-XDH途徑)，得到共利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖的重組菌株[76,82]，共糖發(fā)酵乙醇產(chǎn)率達到0.43g/g(Total sugar)，達到理論值的84%，且沒有副產(chǎn)物木糖醇和阿拉伯糖醇的積累。進一步采用適應(yīng)性進化策略選育，使重組菌株對30 g/L葡萄糖、15 g/L木糖和15 g/L L-阿拉伯糖的共發(fā)酵時間從60 h降為35 h，但乙醇得率沒有變化。本課題組將細菌的阿拉伯糖初始代謝途徑和木糖的XR-XDH與XI代謝途徑共表達，獲得了三糖代謝菌株BSW4XA3，木糖和L-阿拉伯糖的消耗速率相近，實現(xiàn)戊糖同步利用，而且葡萄糖的代謝效率不受影響[19]，大大推進了釀酒酵母三糖共代謝工程的研究進程。

3 討論與展望

構(gòu)建高效發(fā)酵木質(zhì)纖維素全糖組分的釀酒酵母二倍體工程菌株，是纖維素乙醇規(guī)模化生產(chǎn)與應(yīng)用的前提條件之一。釀酒酵母的葡萄糖利用能力很強，且工程菌也能利用木糖和L-阿拉伯糖，但戊糖代謝能力依然有待進一步提高。轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)是木糖和L-阿拉伯糖進入釀酒酵母細胞進行代謝的第一步，也是限制兩種戊糖代謝水平的瓶頸問題之一，這一過程尤其受到葡萄糖的強烈抑制。構(gòu)建高效利用戊糖的重組釀酒酵母菌株，需要篩選得到對兩種戊糖轉(zhuǎn)運能力和親和力更高的轉(zhuǎn)運蛋白。迄今為止，在釀酒酵母中已報道了一些內(nèi)源和異源功能性表達的戊糖轉(zhuǎn)運蛋白，并對戊糖轉(zhuǎn)運的分子轉(zhuǎn)運機制進行了初步的分析，取得了一定進展；但由于戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的多樣性和復(fù)雜性，以及研究技術(shù)等問題的限制，整體研究工作尚需要進一步深入。目前，雖已獲得了幾個解除葡萄糖抑制的木糖專一性轉(zhuǎn)運蛋白，但在野生型釀酒酵母中，葡萄糖的利用效率仍舊高于木糖，兩者的協(xié)同共利用效率尚需進一步提高。質(zhì)子同向型轉(zhuǎn)運蛋白對戊糖的轉(zhuǎn)運偏好性較高，是提高戊糖轉(zhuǎn)運效率的又一有效手段，但表達活性普遍較弱，尤其是細菌源的戊糖高偏好性轉(zhuǎn)運蛋白尚未在釀酒酵母中活性表達?，F(xiàn)在雖有細菌源木糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)的解析，但釀酒酵母中表達的戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的真實晶體結(jié)構(gòu)尚不清楚，如何成功解析酵母菌戊糖轉(zhuǎn)運蛋白的晶體結(jié)構(gòu)是擺在我們面前的一大難題。通過一些有效的研究策略，獲得更高活性的木糖和L-阿拉伯糖專一性轉(zhuǎn)運蛋白突變子，實現(xiàn)葡萄糖和兩種戊糖協(xié)同代謝，是提高釀酒酵母纖維素乙醇生成效率、推動規(guī)?；a(chǎn)進程的重要前提。

釀酒酵母二代燃料乙醇的規(guī)模化發(fā)酵，需要完成葡萄糖和木糖的高效糖醇轉(zhuǎn)化。除了轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)，目前也已進行了大量胞內(nèi)木糖代謝途徑和表達調(diào)控研究，大大提高了高效共轉(zhuǎn)化木糖/葡萄糖能力。后續(xù)需要進一步通過代謝工程和合成生物學(xué)策略提高葡萄糖存在下的木糖代謝效率，以及提高菌株對上游工藝過程產(chǎn)生抑制物的耐受性，提升應(yīng)用價值。隨著研究的不斷深入，木糖和L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白和代謝工程研究將在推動適于木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)釀酒酵母工業(yè)菌株的選育和應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。