徐 田，畢 瑋,2，陳 劍,2

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201; 2.國家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室；云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

巨龍竹(Dendrocalamussinicus)又名歪腳龍竹，禾本科竹亞科牡竹屬竹種，稈高20～30 m，直徑20～30 cm，花期10月至次年5月，果期12月至次年7月[1-3]。巨龍竹是目前所知世界上最高大的竹子，也是生長最快，稈形最高大，單稈出材率和單位面積產(chǎn)量最高的竹種，單稈重量可達(dá)79～100 kg，每叢平均有15～30株，其生長速度快、經(jīng)濟(jì)用途廣、生態(tài)效益顯著的特點(diǎn)，使其作為特色明顯的資源之物，有很大的開發(fā)潛力和廣泛的應(yīng)用前景。并且巨龍竹地下莖根系統(tǒng)發(fā)達(dá)，有很好的固土保水能力，是優(yōu)良的生態(tài)防護(hù)竹種。巨龍竹是熱性巨大型叢生竹，分布區(qū)域非常狹窄，就目前所知巨龍竹僅分布于我國云南的西南部邊緣的熱帶和南亞熱帶中山山地，海拔500～1 870 m，年均氣溫15～22.5 ℃，極端低溫不低于-5.4 ℃，最冷月平均氣溫不低于10 ℃，年總光照時(shí)數(shù)在1 800 h以上，年平均有霜日數(shù)不超過12 d，年平均降雨量1 278 mm以上[4]。以普洱市的西盟、瀾滄、孟連和臨滄市的滄源、耿馬、雙江、鎮(zhèn)康、永德為原產(chǎn)地，在西雙版納的勐海、景洪、勐臘等地的河谷壩區(qū)引種栽培。因巨龍竹分布區(qū)也是佤族、傣族、拉祜族等少數(shù)民族聚集區(qū)，其在種質(zhì)資源、地理分布、人文文化上都具有不可替代性，是非常珍稀、特有的竹種。由于具有較大的推廣價(jià)值和較窄的分布范圍，對于巨龍竹的抗逆性研究已經(jīng)迫在眉睫。溫度成為巨龍竹擴(kuò)大分布范圍的關(guān)鍵性制約因素，對于其抗寒性能的研究，已成為推廣巨龍竹需解決的首要問題，也是發(fā)展巨龍竹產(chǎn)業(yè)的重中之重[1-3]。

植物抗寒性是植物抵御外界低溫等不良環(huán)境時(shí)表現(xiàn)的自適應(yīng)能力，這種能力包括了植物自身的遺傳變異以及環(huán)境對植物的自然選擇[5]。自然界中，影響植物生長的最為重要的環(huán)境因子之一是溫度，它很大程度上決定了植物的一些生長發(fā)育、生命進(jìn)程等生命重要環(huán)節(jié)[6]。決定植物的分布和引種最重要的因素之一是溫度，低溫會(huì)對植物生長、結(jié)果、生產(chǎn)等產(chǎn)生嚴(yán)重危害。低溫脅迫指環(huán)境溫度在植物正常生長所需最適溫度以下，包括冷害和凍害[7-8]。朱根海等的研究表明應(yīng)用相對電導(dǎo)率和Logistic 方程求拐點(diǎn)溫度能比較準(zhǔn)確地估計(jì)出植物組織的低溫半致死溫度,此方法適用于多種植物的抗寒性研究[9]。試驗(yàn)通過對巨龍竹幼苗葉片進(jìn)行人工低溫脅迫，用相對電導(dǎo)率和Logistic 方程計(jì)算半致死溫度，為以后巨龍竹引種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料用2年生實(shí)生巨龍竹幼苗，巨龍竹多用2年生幼苗在雨季造林，造林后第1個(gè)冬季是對巨龍竹幼苗抗寒性考驗(yàn)最為嚴(yán)竣的1個(gè)季節(jié)。實(shí)生種子采集于西盟縣中課鄉(xiāng)，地理位置為22°43′41″ N， 99°32′29″ E，海拔1 295 m；中課鄉(xiāng)屬亞熱帶南亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年降雨量2 235 mm，年日照量達(dá)1 693.6 h，干濕氣候分明，土壤主要以磚紅壤和赤紅壤為主，土壤質(zhì)地偏酸，缺鈣少磷。收集到種子后在云南省林業(yè)科學(xué)院樹木園大棚內(nèi)實(shí)生育苗，云南省林業(yè)科學(xué)院昆明樹木園土壤類型為紅壤，海拔1 968 m，年平均氣溫14.7 ℃，最高氣溫31.5 ℃，最低氣溫-7.8 ℃，≥10℃的積溫4 799.3 ℃，平均無霜期280 d，全年日照時(shí)數(shù)≥2 249.3 h；年降水量1 100 mm，相對濕度72%。

1.2 方法

1.2.1低溫脅迫試驗(yàn)方法 2014年12月進(jìn)行，在巨龍竹苗中部的部位上采集成熟、完整、無病蟲害的葉片，放入已貼好標(biāo)簽的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后用自來水清洗葉片，然后用蒸餾水沖洗3次，用濾紙將水分吸干。取自封袋的葉片分為5組，以調(diào)溫冰箱為低溫控制設(shè)備，溫度梯度設(shè)置為： 5、0、-5、-10、-15 ℃，每級溫度處理24 h。根據(jù)以往觀測，巨龍竹在溫度達(dá)到2～0 ℃時(shí)，表面即有受傷表現(xiàn)，耐受極端低溫為-5.4 ℃，將測試溫度定于5～-15 ℃之間。每個(gè)梯度處理完畢后，先對處理后的材料外觀觀測，之后迅速測定其相對電導(dǎo)率。每個(gè)處理測試3個(gè)樣品，取平均值。

1.2.2相對電導(dǎo)率的測定方法 測定時(shí)，沿葉柄向葉尖處打孔，孔徑0.6 cm，取15片葉圓片放入試管中加入20 mL蒸餾水，封口后在水平搖床上震蕩1 h后在沸水中加熱20 min，冷卻到室溫，蒸餾水設(shè)為空白對照，用奧利龍150A型電導(dǎo)率儀分別測定加熱前電導(dǎo)值C1，及加熱后電導(dǎo)值C2，及對照電導(dǎo)率C0，3次重復(fù)。并按以下公式計(jì)算相對電導(dǎo)率：

相對電導(dǎo)率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%

式中：C0—蒸餾水電導(dǎo)率；C1—煮前電導(dǎo)率；C2—煮后電導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算

數(shù)據(jù)整理、計(jì)算、匯總以及半致死低溫計(jì)算用Microsoft Office Excel 2010軟件完成，用SPSS 18.0完成重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對相對電導(dǎo)率的影響

經(jīng)過24 h的人工低溫處理后，在不同的溫度梯度下，巨龍竹葉片在形態(tài)上無明顯變化，無褐變，無失水卷曲。低溫對植物組織造成傷害后，細(xì)胞膜透性會(huì)受到損壞，細(xì)胞膜內(nèi)電解質(zhì)滲出會(huì)有所變化，細(xì)胞膜透性越大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲量也相應(yīng)增加。相對電導(dǎo)率是表現(xiàn)低溫造成的細(xì)胞膜受損前后胞內(nèi)電解質(zhì)滲出率。一般認(rèn)為相對電導(dǎo)率增加的程度一定程度上反映了植物組織細(xì)胞膜受傷害的程度，同時(shí)也反映了細(xì)胞抗性的大小，很多情況下相對電導(dǎo)率也可作為植物抗寒性強(qiáng)弱評價(jià)的一個(gè)可靠指標(biāo)[10-11]。

圖1 巨龍竹葉片在低溫脅迫下相對電導(dǎo)率變化曲線Fig.1 The relative conductivity of bamboo leaves under low temperature stress

隨著溫度的降低，巨龍竹幼苗葉片電導(dǎo)率呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(圖1 )，表明溫度與相對電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。5 ℃到0 ℃時(shí)，相對電導(dǎo)率只是少量增加，說明葉片細(xì)胞膜受傷害不明顯；從0 ℃到-5 ℃時(shí)，電導(dǎo)率急劇升高，由32%迅速上升到68%，說明當(dāng)溫度下降至-5 ℃時(shí)，巨龍竹葉片細(xì)胞膜受傷害嚴(yán)重；之后上升速度又趨于平緩。隨溫度的降低，相對電導(dǎo)率變化曲線呈“S”型，相對電導(dǎo)率隨溫度的變化基本遵循Logistic 曲線的變化規(guī)律，即呈緩慢增加、快速增加、平緩增加的趨勢，因此降溫對膜透性破壞性效應(yīng)的最大值在S 曲線上為拐點(diǎn)所對應(yīng)的數(shù)值，在抗寒研究上即為低溫半致死溫度(LT50)[12-13]。

2.2 配合Logistic方程求半致死溫度

Sukumaran 等提出電解質(zhì)外滲率50%時(shí)的溫度為組織的低溫半致死溫度[14],而朱根海等認(rèn)為可以用Logistic 方程中拐點(diǎn)溫度來表示植物組織的低溫半致死溫度(LT50)[9],羅正榮等認(rèn)為細(xì)胞電解質(zhì)外滲率(REC)配以Logistic 方程兩者具有很好的擬合度[15]。Logistic方程是一個(gè) “S”型曲線方程，其擬合方程為y=k/(1+ae-bx)(k，a，b為常數(shù))，拐點(diǎn)溫度為半致死溫度(LT50)，即(d2y/dx2)=0時(shí)的x值[16]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)巨龍竹幼苗葉片在低溫處理下的電導(dǎo)率，擬合Logistic方程：Y=K/(1+ae-bt)，擬合值R為0.907(P<0.05)，呈顯著水平，說明在巨龍竹抗寒研究中，不同低溫處理的電解質(zhì)外滲率遵循Logistic方程的變化規(guī)律，其擬合結(jié)果比較可靠，精確度較高[16]。確定拐點(diǎn)溫度(LT50)，即為其半致死溫度為-2.16 ℃，具體的Logistic方程及參數(shù)、半致死溫度見表1。

表1 巨龍竹低溫半致死溫度Tab.1 The semi-lethal low temperature of Dendrocalamus sinicus

3 結(jié)論

低溫脅迫傷害時(shí)，植物最先受損部位是膜系統(tǒng)，低溫會(huì)引起細(xì)胞膜的不均勻收縮、膜脂相變、膜脂過氧化以及冰凍造成的機(jī)械脅迫等都會(huì)傷害到細(xì)胞，細(xì)胞膜的半透性喪失，細(xì)胞電解質(zhì)外滲，細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重則離子滲出率越高，因此可通過測定電解質(zhì)滲漏情況來確定植物的受害程度[11]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過24 h的人工低溫處理后，在不同的溫度梯度下，巨龍竹葉片在形態(tài)上無明顯變化，無褐變，無失水卷曲；巨龍竹葉片經(jīng)過低溫脅迫后，隨溫度的降低相對電導(dǎo)率會(huì)增加，呈“S”型變化，應(yīng)用Logistic方程計(jì)算其半致死溫度為-2.16 ℃，相關(guān)系數(shù)0.907，表明低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率遵循Logistic 方程的變化規(guī)律。

4 討論

試驗(yàn)所設(shè)置的低溫脅迫時(shí)間是24 h，對于48、72 h及更長時(shí)間的持續(xù)低溫脅迫是否適用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)試驗(yàn)僅研究了低溫脅迫下2年生巨龍竹幼苗的離體葉片，對于多年生以及整株的測定還需進(jìn)一步研究。

植物生理過程是極其復(fù)雜的，影響巨龍竹抗寒性能的因素也是多方面的，要進(jìn)一步研究其抗寒機(jī)能，需要綜合其他生理生化指標(biāo)進(jìn)行全面評價(jià)。

圖2 低溫脅迫后巨龍竹幼苗葉片狀態(tài)Fig.2 Leaf state of Dendrocalamus sinicus seedlings after low temperature stress