楊慧敏，吳良如

(1.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012；2.浙江省竹子高效加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012)

近年來從植物中發(fā)現(xiàn)了越來越多具有較好抗癌活性的蛋白或小分子多肽，已成為藥物研發(fā)中的一個(gè)活躍領(lǐng)域。隨著分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定等研究方法的飛速發(fā)展，越來越多的具有某種生物活性及藥用價(jià)值的天然多肽類化合物被鑒定出來[1-2]。付蕓等[3]從天南星科植物半夏(Pinelliaternata)塊莖鮮汁中分離純化的植物蛋白，可明顯抑制Bel-7402 細(xì)胞生長的同時(shí)可促進(jìn)Bel-7402細(xì)胞凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)半夏提取物也能誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞SNU-17的細(xì)胞凋亡[4]。鄧乾春等[5]從白果中提取分離得到的白果清蛋白，能抑制體內(nèi)S180實(shí)體瘤和體外S180細(xì)胞的生長，并具有清除·OH和O2·的能力。薛照輝等[6]發(fā)現(xiàn)酶酶解的菜籽清蛋白作用于小鼠體內(nèi)，能明顯抑制小鼠體內(nèi)肉瘤的生長，同時(shí)可提高小鼠自身免疫能力。

竹筍在我國具有悠久的藥用和保健歷史[7-8]。中醫(yī)認(rèn)為，竹筍性味甘寒、入肺胃經(jīng)，有清熱化痰、解毒透瘆、和中潤腸的功效，適用于熱毒痰火內(nèi)盛、胃熱嘈雜、口干便秘、咳嗽痰多、食積不化、脘腹脹滿等病癥[9]。Fujimura等[10]從毛竹筍中分離出2種具有抗致病菌和抗真菌功能的多肽Pp-AMP1和Pp-AMP2，通過分析其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其與槲寄生毒肽(viscotoxin)有大約70%的同源性，與硫堇蛋白有40%左右的同源性。槲寄生毒肽對多種腫瘤細(xì)胞系，如人肺癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人腦瘤細(xì)胞等，具有細(xì)胞毒活性，對惡性腫瘤細(xì)胞有抑制作用，還有免疫調(diào)節(jié)作用，能預(yù)防腫瘤的生長。Wang等[11]從麻竹筍中得到分子量為20 kDa的抗真菌蛋白Dendrocin，它能抑制菌絲體的生長，經(jīng)分析N端序列發(fā)現(xiàn)其與類甜蛋白相似，但分子量更小些，且這種蛋白不像其他抗菌蛋白一樣具有紅細(xì)胞凝集和核糖核酸酶活性；Maekawa等[12]從竹筍中分離到3個(gè)與酪蛋白激酶II相關(guān)的60S酸性核糖體P蛋白(13 kDa，15 kDa和35 kDa)具有很強(qiáng)的體內(nèi)磷酸化抑制作用。從這些為數(shù)不多的研究中，我們可以驚喜地發(fā)現(xiàn)從竹筍資源中尋找具生理活性的功能蛋白或活性多肽將具有非常大的潛力和無限的可能性?；诖?，本研究對不同種屬的24種竹筍蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖的影響進(jìn)行研究，探究不同濃度的竹筍蛋白對SGC7901和HCT116細(xì)胞增殖的影響，試圖從中篩選出影響癌細(xì)胞增殖活性的竹筍蛋白，為抗癌新藥的研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫(http：//www.cellbank.org.cn/)；胎牛血清(貨號：SH30396.03)和RPMI-1640培養(yǎng)基(SH30809.01)均購自Hyclone公司；CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(貨號KGA312)；植物蛋白提取試劑盒(貨號：KGP7100)和青鏈霉素混合液(貨號：KGY0023)均購自上海銳賽生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，采用RPMI1640培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素混合液)接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并置于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.2.2竹筍蛋白提取 稱取100～200 mg竹筍，置于液氮中過夜，在液氮環(huán)境中樣本至粉碎。加入1 mL Lysis Buffer工作液[每mL Lysis Buffer加入1 μL蛋白酶抑制劑，10 μL DTT和10 μL PMSF(100 mM)]，4 ℃孵育30 min，每10 min渦旋混勻一次。完全裂解后(無明顯沉淀)， 4 ℃，14 000 rpm離心10 min，收集上清即為蛋白提取物。BCA法測定蛋白液濃度，并分裝保存于-70 ℃。

1.2.3竹筍蛋白孵育胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 實(shí)驗(yàn)前一天，分別將胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞計(jì)數(shù)，按3.5×103·孔-1接種于96孔板，37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞密度長至60%～70%時(shí)將竹筍蛋白按0.02 mg·mL-1與培養(yǎng)基一起作用于上述細(xì)胞，72 h后倒置顯微鏡拍照，記錄細(xì)胞生長狀況。

1.2.4細(xì)胞增殖活性檢測-CCK-8法 細(xì)胞用竹筍蛋白(實(shí)驗(yàn)前將竹筍蛋白用完全培養(yǎng)基按1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500的比例稀釋)處理72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻后培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h，酶標(biāo)儀測OD450 nm的吸光度值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

抑制率% =(1-加藥OD值/陰性對照OD值)×100%

1.2.5IC50值(半抑制濃度)的計(jì)算 采用GraphPad Prism 軟件，根據(jù)上述各增殖抑制率，計(jì)算其IC50值。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS v21.0(http：//spss.en.softonic.com/)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Student′st-檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)差異顯著性分析，*P<0.05定義為顯著性差異，**P<0.01定義為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 備選24種竹子基本信息

為了探討不同新鮮竹筍蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖的影響，我們選取了24種竹子進(jìn)行相關(guān)研究，詳細(xì)種屬信息如表1所示。

表1 24株備選竹子的基本信息匯總Tab.1 Basic information on 24 Bamboo species under study

2.2 不同濃度竹筍蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用

將不同濃度竹筍蛋白作用于胃癌細(xì)胞SGC7901，72 h后，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖2所示，奉化水竹、黃古竹、油苦竹、黃紋竹、少穗竹和黃竿烏哺雞竹的竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率成正比，隨濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率越明顯。此外，對于多數(shù)竹筍蛋白，低濃度處理細(xì)胞時(shí)，隨蛋白濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率降低，但是高濃度處理時(shí)，濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率也越高。24種竹筍蛋白均可抑制SGC7901細(xì)胞增殖，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越明顯。

圖1 不同濃度蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effects of bamboo shoot protein with different concentrations on the proliferation of SGC7901 cells(A1-F1分別表示紫竹、花毛竹、橄欖竹、黃曲竿竹、曲竿竹、金明竹；A2-F2分別表示短穗竹、黃古竹、角竹、篌竹、奉化水竹、水竹；A3-F3分別表示黃紋竹、富陽烏哺雞竹、花哺雞竹、壽竹、水竹、毛竹；A4-F4分別表示紫蒲頭灰竹、白哺雞竹、甜筍竹、油苦竹、少穗竹、黃竿烏哺雞竹)

2.3 不同濃度竹筍蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用

將不同濃度竹筍蛋白作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，72 h后CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖3所示，花毛竹、黃曲竿竹、奉化水竹、木竹、紫蒲頭灰竹、黃紋竹、壽竹、白哺雞竹、黃古竹、少穗竹和黃竿烏哺雞竹的竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率成正比。對于橄欖竹、金明竹、短穗竹、角竹、花哺雞竹和毛竹，低濃度處理細(xì)胞時(shí)，隨蛋白濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率降低，但是高濃度處理時(shí)，濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率也越高。對于其他竹筍蛋白，不同濃度作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率不規(guī)律，但仍可以抑制細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示24種竹筍蛋白中，多數(shù)竹筍蛋白可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的增殖，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越明顯。

圖2 不同濃度蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖的影響Fig.2 The effects of bamboo shoot protein with different concentrations on the proliferation of HCT116 cells(A1-F1分別表示紫竹、花毛竹、橄欖竹、黃曲竿竹、曲竿竹、金明竹；A2-F2分別表示短穗竹、黃古竹、角竹、篌竹、奉化水竹、水竹；A3-F3分別表示黃紋竹、富陽烏哺雞竹、花哺雞竹、壽竹、水竹、毛竹；A4-F4分別表示紫蒲頭灰竹、白哺雞竹、甜筍竹、油苦竹、少穗竹、黃竿烏哺雞竹)

2.4 24種竹筍蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖活性的影響

在一定濃度范圍內(nèi)，不同竹筍蛋白均可抑制SGC7901和HCT116細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種抑制作用，我們將提取的24種稀釋成不同濃度的竹筍蛋白作用于SGC7901和HCT116細(xì)胞株72 h后，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況，加以驗(yàn)證其對腫瘤株細(xì)胞增殖活性的影響。

例如，圖3為24種提取的竹筍蛋白原液稀釋50倍后作用于胃癌細(xì)胞株SGC7901，培養(yǎng)72 h后顯微鏡下的細(xì)胞生長情況。從圖中我們可以明顯地看到，與對照組相比，24種竹筍蛋白作用于胃癌細(xì)胞株SGC7901后，細(xì)胞數(shù)明顯的少于對照組，尤其是橄欖竹(圖3-D1)、角竹(圖3-A2)、曲竿竹(圖3-C3)、短穗竹(圖3-E3)、白哺雞竹(圖3-A5)以及少穗竹(圖3-D5)組細(xì)胞數(shù)最少，說明24種提取竹筍蛋白原液稀釋50倍后均可抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901的增殖。

圖3 24種竹筍蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖的影響Fig.3 The effects of proteins of 24 species of bamboo shoots on the proliferation of SGC7901 cells(A1-E1分別表示對照組、紫竹、花毛竹、橄欖竹、黃曲竿竹；A2-E2分別表示角竹、篌竹、奉化水竹、水竹、木竹；A3-E3分別表示毛竹、紫蒲頭灰竹、曲竿竹、金明竹、短穗竹；A4-E4分別表示黃古竹、黃紋竹、富陽烏哺雞竹、花哺雞竹、壽竹；A5-E5分表表示白哺雞竹、甜筍竹、油苦竹、少穗竹、黃竿烏哺雞竹)

圖4為24種提取的竹筍蛋白原液稀釋50倍后作用于結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，培養(yǎng)72 h后顯微鏡下的細(xì)胞生長情況。與對照組相比，24種竹筍蛋白作用結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116后，細(xì)胞數(shù)明顯的少于對照組，尤其是橄欖竹(圖4-D1)、奉化水竹(圖4-C2)、曲竿竹(圖4-C3)、黃古竹(圖4-A4)、甜筍竹(圖4-B2)、少穗竹(圖4-D5)以及黃竿烏哺雞竹(圖4-E5)作用組細(xì)胞數(shù)最少，說明24種提取的竹筍蛋白原液稀釋50倍后均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的增殖。

圖4 24種竹筍蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116增殖的影響Fig.4 The effects of proteins of 24 species of bamboo shoots on the proliferation of HCT116 cells(A1-E1分別表示對照組、紫竹、花毛竹、橄欖竹、黃曲竿竹；A2-E2分別表示角竹、篌竹、奉化水竹、水竹、木竹；A3-E3分別表示毛竹、紫蒲頭灰竹、曲竿竹、金明竹、短穗竹；A4-E4分別表示黃古竹、黃紋竹、富陽烏哺雞竹、花哺雞竹、壽竹；A5-E5分表表示白哺雞竹、甜筍竹、油苦竹、少穗竹、黃竿烏哺雞竹)

2.5 24種竹筍蛋白對胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的半抑制濃度

根據(jù)各不同梯度濃度的竹筍蛋白作用于腫瘤細(xì)胞的不同增殖抑制率，采用GraphPad Prism 軟件，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度(或稱半抑制率)，即IC50值，見表2(表中毛竹、曲竿竹和篌竹因其竹筍蛋白不同梯度濃度的抑制率值異常，無法計(jì)算其IC50值)。一般IC50的數(shù)值越小，說明其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的特異性能越強(qiáng)。從表2數(shù)據(jù)分析可知，對胃癌細(xì)胞株SGC7901抑制率最強(qiáng)的是花毛竹，其次是篌竹，然后依次是紫竹、毛竹、曲竿竹、花哺雞竹、甜筍竹、角竹、短穗竹、水竹、油苦竹、黃曲竿竹、壽竹、黃古竹、木竹、金明竹、白哺雞竹、黃紋竹、

表2 24種竹筍蛋白對腫瘤細(xì)胞抑制的IC50值Tab.2 IC50 values of protein of 24 species of bamboo shoots in inhibiting tumor cells

橄欖竹、富陽白哺雞竹、奉化水竹、紫蒲頭灰竹、少穗竹，抑制率最弱的是黃竿烏哺雞竹。對結(jié)腸癌細(xì)胞株SGC7901抑制率最強(qiáng)的是花毛竹，其次是水竹，然后依次是木竹、黃紋竹、奉化水竹、壽竹、黃古竹、黃曲竿竹、白哺雞竹、油苦竹、金明竹、角竹、紫蒲頭灰竹、甜筍竹、少穗竹、橄欖竹、黃竿烏哺雞竹、富陽烏哺雞竹、花哺雞竹、短穗竹，抑制率最弱的是紫竹?；袷瞧渲袑ξ赴┘?xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的增殖抑制率均最強(qiáng)的竹種，而其他竹種的竹筍蛋白對這2種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用并無呈現(xiàn)出一定的種屬特異性規(guī)律。

3 結(jié)論與討論

竹筍蛋白對腫瘤細(xì)胞，如胃癌細(xì)胞SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116均有顯著的抑制作用。同一種竹筍蛋白對不同腫瘤細(xì)胞的抑制率不完全相同，并與竹筍蛋白的濃度密切相關(guān)。在胃癌細(xì)胞SGC7901中，奉化水竹、黃古竹、油苦竹、黃紋竹、少穗竹和黃竿烏哺雞竹的竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率成正比，隨濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率越明顯。此外，對于多數(shù)竹筍蛋白，低濃度處理細(xì)胞時(shí)，隨蛋白濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率降低，但是高濃度處理時(shí)，濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率也越高。對于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，花毛竹、黃曲竿竹、奉化水竹、木竹、紫蒲頭灰竹、黃紋竹、壽竹、白哺雞竹、黃古竹、少穗竹和黃竿烏哺雞竹的竹筍蛋白濃度與細(xì)胞增殖抑制率成正比。對于橄欖竹、金明竹、短穗竹、角竹、花哺雞竹和毛竹，低濃度處理細(xì)胞時(shí)，隨蛋白濃度的增加細(xì)胞增殖抑制率降低，但是高濃度處理時(shí)，濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率也越高。對于其他竹筍蛋白，不同濃度作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率不規(guī)律，但仍可以抑制細(xì)胞增殖?？傊?，在一定濃度范圍內(nèi)，竹筍蛋白濃度越高對胃癌細(xì)胞SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的抑制作用越明顯。本文僅僅在胃癌細(xì)胞株SGC7901和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中研究這24種竹筍蛋白對癌細(xì)胞增殖的影響，其對其他癌細(xì)胞株的增殖是否具有抑制作用尚不明確，以及他們抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制也不清楚，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討這些問題。

在相關(guān)蛋白類藥物的研究中表明[13-14]：與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，蛋白類藥物在有效增強(qiáng)藥效的同時(shí)，對機(jī)體正常細(xì)胞、組織的損傷較小，這是蛋白類藥物研究的又一大突破性的優(yōu)勢。對于竹筍蛋白抑制胃癌細(xì)胞以及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的發(fā)現(xiàn)，我們試圖從中篩選出影響多種癌細(xì)胞增殖活性較相似的竹筍蛋白，進(jìn)一步探究抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，為抗癌新藥的研究提供新的理論依據(jù)。