薛成俊 周燏 徐濤 呂小婷 鄭璐 周忠海

金絲桃苷又稱槲皮素3-D-半乳糖苷，屬于黃酮醇類中藥單體化合物，是槲皮素天然的衍生物，可由金絲桃科、杜鵑花科、衛(wèi)矛科等多種科屬植物中萃取獲得。金絲桃苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、利尿、降低膽固醇、心肌缺血保護及免疫調節(jié)等藥理作用[1-2]。NK細胞作為機體的固有免疫細胞，占外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的5%～15%，是機體抗腫瘤的第一道防線，殺傷細胞迅速，無需抗原致敏即可直接殺傷敏感的腫瘤細胞，在抗新生瘤、已形成腫瘤及轉移瘤中均發(fā)揮重要作用[3]。既往研究報道多種方法可增強NK細胞的腫瘤殺傷活性[4-5]。近年開發(fā)中藥單體成分對人免疫細胞增強效應的研究逐漸增多[6-8]。本研究觀察金絲桃苷對人NK細胞增殖及殺傷胰腺癌細胞的效應，并初步探討其機制。

材料與方法

一、人NK細胞的培養(yǎng)和鑒定

取健康志愿者外周血100 ml，經Ficoll淋巴細胞分離液分離獲得PBMCs，生理鹽水洗滌后調整細胞密度為1.5×107/ml，取100 μl細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板。每孔加含IL-2(廈門特寶生物工程股份有限公司)及5%血清的NK細胞培養(yǎng)液3 ml(CellGenixTM GMP SCGM)誘導PBMCs，同時添加0.3、1.6、8、40、200 μg/ml DMSO溶解的金絲桃苷溶液作為金絲桃苷組，每組設3個復孔，以單純加DMSO作為對照組，常規(guī)培養(yǎng)12 d。觀察細胞形態(tài)并收集細胞，調整細胞密度為1×107/ml，取100 μl細胞懸液加入FITC標記的抗人CD56(6 μg/ml)和PerCP-cy5.5標記的抗人CD3(3 μg/ml)各20 μl，室溫避光孵育20 min，PBS洗滌2遍后以400 μl PBS重懸，上流式細胞儀(BD FACSCalibur)鑒定NK細胞表型。

二、NK細胞增殖能力檢測

采用以上細胞分組，培養(yǎng)前行PBMCs計數，分兩部分，一部分培養(yǎng)12 d后收集細胞，采用臺盼藍拒染法計數存活細胞數，另一部分在培養(yǎng)前及培養(yǎng)12 d后采用上述方法上流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞百分含量，計算各組NK細胞增殖倍數。增殖倍數=金絲桃苷誘導后活細胞數×培養(yǎng)后NK細胞含量(%)/PBMCs 數×培養(yǎng)前NK細胞含量(%)。

三、NK細胞穿孔素及顆粒酶B表達檢測

取上述金絲桃苷各濃度組和對照組標記的1×107/ml NK細胞20 μl，加入100 μl Fix&Perm破膜劑A避光孵育15 min，PBS洗滌后加入破膜劑B，同時加入5 μl PE標記的穿孔素抗體(12 μg/ml)或5 μl PE標記的顆粒酶B抗體(25 μg/ml)，室溫避光繼續(xù)孵育20 min，PBS洗滌后以400 μl PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測穿孔素或顆粒酶B水平，分別以PE標記的anti-IgG2bκ或PE標記的anti-IgG1作為同型對照。

四、NK細胞殺傷胰腺癌PANC1細胞活性檢測

取上述金絲桃苷各濃度組和對照組NK細胞作為效應細胞，調整細胞密度為2×108/L。取對數生長期的PANC1癌細胞株作為靶細胞，調整細胞密度為1×107/L，以效靶比為20∶1混合，同時設效應細胞自然釋放管、靶細胞自然釋放管及靶細胞最大釋放管，每組設3個復管。常規(guī)培養(yǎng)6 h，1 500 r/min離心10 min，收集上清液置Encore自動生化分析儀，應用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放法測定各管340 nm波長處吸光值(A340值)，計算殺傷活性。殺傷活性(%)=(實驗組A340值-效應細胞自然釋放組A340值)/(靶細胞最大釋放組A340值-靶細胞自然釋放組A340值)×100%。

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、人NK細胞鑒定

PBMCs培養(yǎng)12 d后在倒置顯微鏡下可見大小不一的細胞集落黏附在細胞培養(yǎng)板底部。金絲桃苷各濃度誘導組和對照組NK細胞含量均達到79.65%，NK細胞表型為CD3-CD56+(圖1)，表明NK細胞擴增成功。

圖1 NK細胞的形態(tài)(1A， ×400)及其CD3-CD56+ 表型細胞比例(1B)

二、金絲桃苷對NK細胞增殖的影響

0.3～8 μg/ml金絲桃苷以濃度依賴性促進人NK細胞增殖，8 μg/ml時細胞增殖率最高，為(43.35±4.58)%。誘導培養(yǎng)12 d時，0.3、1.6、8 μg/ml金絲桃苷組增殖倍數分別為(93.76±8.77)、(106.67±12.35)、(118.50±11.51)倍，顯著高于對照組的(73.70±9.43)倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.048、0.001、0.000)。40、200 μg/ml金絲桃苷組的增殖倍數分別為(81.91±13.96)、(80.36±13.24)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義。

三、金絲桃苷對NK細胞穿孔素、顆粒酶B表達的影響

1.6、8、40 μg/ml金絲桃苷組NK細胞穿孔素水平顯著高于對照組，1.6、8 μg/ml金絲桃苷組NK細胞顆粒酶B水平顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。

四、金絲桃苷對NK細胞殺傷PANC1細胞活性的影響

1.6、8 μg/ml金絲桃苷組NK細胞殺傷PANC1細胞活性分別為(63.18±3.77)%、(65.34±4.97)%，顯著高于對照組的(52.16±5.48)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.012、0.003)。0.3、40、200 μg/ml金絲桃苷組NK細胞殺傷PANC1細胞活性分別為(53.31±4.40)%、(60.00±3.54)%、(55.51±4.81)%，與對照組差異無統(tǒng)計學意義。

組別穿孔素P值顆粒酶BP值對照組72.93±2.0682.35±2.730.3 μg/ml組71.77±3.330.97281.67±2.630.9941.6 μg/ml組82.34±2.900.00187.30±1.700.0448.0 μg/ml組89.15±3.540.00092.16±3.050.00040 μg/ml組81.78±2.810.00286.32±2.310.130200 μg/ml組76.01±3.020.47084.94±2.220.458

討 論

NK細胞是固有免疫細胞重要組成成分，在機體抗感染、抗腫瘤免疫防御中發(fā)揮著第一道防線的作用。NK細胞分泌IFN-γ 等腫瘤細胞抑制性細胞因子，能通過NKG2D、DNAM-1等NK細胞相關受體/配體直接殺傷腫瘤細胞，而且還能促進腫瘤特異性殺傷T細胞增殖[9]。隨著研究的深入，NK細胞成為體外擴增培養(yǎng)用于腫瘤過繼性免疫治療的效應細胞[4]。金絲桃苷的抗腫瘤效應在多種腫瘤研究中得到了證實，可通過Bcl-2及NF-κB信號途徑抑制胰腺癌細胞生長及誘導其凋亡[2]，通過p53途徑抑制SW620結腸癌細胞并誘導其凋亡[10]，通過Akt/mTOR/p70S6K信號途徑誘導肺癌細胞自噬和凋亡[11]。

顆粒酶B是一種調節(jié)炎癥反應、凋亡和抗病毒免疫的絲氨酸蛋白酶，是細胞毒活性的重要標志物[12]。穿孔素作為穿孔蛋白幫助顆粒酶B進入靶細胞，二者協(xié)同作用有利于維持內環(huán)境穩(wěn)定及調節(jié)炎癥反應，顆粒酶-穿孔素途徑是NK細胞殺傷腫瘤細胞的主要機制之一[13]。

本研究結果顯示，金絲桃苷在0.3～8 μg/ml范圍內可促進NK細胞體外增殖，但隨著金絲桃苷濃度的繼續(xù)增加，其促增殖作用減弱，明確了金絲桃苷作用的濃度范圍，為今后對金絲桃苷藥理作用的實驗研究奠定基礎。

本研究結果還顯示，適當濃度的金絲桃苷誘導可增強NK細胞對PANC1細胞的殺傷活性，且增加NK細胞顆粒酶B、穿孔素的表達，提示金絲桃苷可能通過上調顆粒酶、穿孔素表達而增強NK細胞的腫瘤殺傷活性。進而拓寬了中藥單體成分金絲桃苷的藥理學應用范圍，為其應用于腫瘤的免疫治療提供實驗依據。