袁秀菊 宿亮 趙靜芝 王玲蘭 袁紅波

摘 要 目的：建立頂空毛細(xì)管GC法同時(shí)測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥中乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮7種殘留溶劑的分析方法。方法：采用Agilent DB-624色譜柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，二甲基亞砜（DMSO）為溶劑。結(jié)果：在選定的色譜條件下，各溶劑峰均能良好分離，溶劑乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮分別在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。各溶劑最低檢測(cè)限符合要求。結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本法可用于富馬酸替諾福韋二吡呋酯的殘留溶劑測(cè)定。

關(guān)鍵詞 核苷酸類(lèi)抗病毒藥 富馬酸替諾福韋二吡呋酯 殘留溶劑 氣相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）19-0077-04

Determination of residual solvents of tenofovir disoproxil fumarate by GC

YUAN Xiujyu*， SU Liang， ZHAO Jingzhi， WANG Linglan， YUAN Hongbo

（Institute of Chemical Material Medica， Academy of Qianjin， Qianjin Group， Hunan Zhuzhou 412003， China）

ABSTRACT Objective： A capillary GC method with head-space sampling was established for determination of residual solvents including ethanol， isopropanol， dichloromethane， ethyl acetate， tetrahydrofuran， N， N-dimethylacetamide and N-methyl-2-pyrrolidone in raw material of tenofovir disoproxil fumarate. Methods： GC was performed on Agilent DB-624 capillary column with FID as detector and DMSO as the solvent. Results： The peaks of these residual solvents could be completely separated from the main constituent. The calibration curves of these solvents showed good linearity with their peak areas over the ranges of related concentrations， respectively. The limit of detection of each solvent could meet the requirements. Conclusion： It is proved by the methodological validation that this method can be used for the determination of the residual solvents remained in tenofovir disoproxil fumarate.

KEy WORDS nucleotide antiviral drug； tenofovir disoproxil fumarate； residual solvents； gas chromatography

富馬酸替諾福韋二吡呋酯片（商品名：韋瑞德，Viread），是美國(guó)吉利德（Gilead）公司開(kāi)發(fā)上市的一種核苷酸類(lèi)抗病毒藥[1]。2001年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于治療抗人免疫缺陷病毒（HIV），后增補(bǔ)抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。替諾福韋是一種無(wú)環(huán)的5-單磷酸腺苷類(lèi)似物，其首先需要經(jīng)二酯的水解轉(zhuǎn)化為替諾福韋，然后通過(guò)細(xì)胞酶的磷酸化形成二磷酸替諾福韋。二磷酸替諾福韋通過(guò)與天然底物5-三磷酸脫氧腺苷競(jìng)爭(zhēng)，并且在與DNA整合后終止DNA鏈，從而抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性[2-5]。此外，體內(nèi)外研究表明，替諾福韋對(duì)HBV野生株、拉米夫定耐藥株、阿德福韋耐藥株均有較好抑制作用，給對(duì)拉米夫定或阿德福韋耐藥患者提供了一個(gè)新型抗乙肝藥物的選擇。

由于該原料藥在制備過(guò)程中使用了有機(jī)溶劑乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮，而依據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）提出的殘留溶劑指導(dǎo)原則，這些溶劑均被列為藥品必須限制的第二、三類(lèi)有機(jī)溶劑[6]，因此為保證藥品質(zhì)量和用藥安全，對(duì)該原料藥進(jìn)行有機(jī)溶劑殘留量檢測(cè)就顯得尤為重要。

目前，有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯中乙醇、異丙醇、乙酸乙酯等溶劑的方法，但未見(jiàn)高沸點(diǎn)溶劑N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道[7-8]。為加強(qiáng)富馬酸替諾福韋二吡呋酯的質(zhì)量控制，本文在詳細(xì)研究的基礎(chǔ)上建立了GC法測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯中7種溶劑的測(cè)定方法，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于富馬酸替諾福韋二吡呋酯的殘留溶劑測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 7890型氣相色譜儀（配備FID檢測(cè)器和7697A型頂空進(jìn)樣裝置）及Agilent 1260工作站（美國(guó)Agilent公司）。

溶劑對(duì)照品：N-甲基吡咯烷酮、乙醇（Tedia公司，HPLC級(jí)）；二氯甲烷、乙酸乙酯（天津市化學(xué)試劑研究所，HPLC級(jí)）；異丙醇、四氫呋喃（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，HPLC級(jí)）；N，N-二甲基甲酰胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析級(jí)）；二甲基亞砜（Honeywell，HPLC級(jí)）；富馬酸替諾福韋二吡呋酯（湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司自制）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

Agilent DB-624柱（30 m×0.32 mm×1.8 mm）；載氣：N2，按表1進(jìn)行程序升溫；進(jìn)樣口溫度：150 ℃，檢測(cè)器溫度：250 ℃，頂空瓶平衡溫度：100 ℃，平衡時(shí)間：30 min。

1.2.2 對(duì)照、供試溶液的配制

對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各溶劑對(duì)照品適量，分別加二甲基亞砜溶解并稀釋制成每1 ml中含乙醇、異丙醇、乙酸乙酯各0.5 mg、二氯甲烷0.06 mg、四氫呋喃0.072 mg、N，N-二甲基甲酰胺0.088 mg和N-甲基吡咯烷酮1.0 mg的混合溶液，精密量取5 ml，置頂空瓶中，密封，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液 取富馬酸替諾福韋二吡呋酯約0.5 g，精密稱(chēng)定，置頂空瓶中，精密加入5 ml二甲基亞砜使溶解，密封，作為供試品溶液。

1.2.3 空白溶液、定位溶液配制

1）空白溶劑干擾試驗(yàn) 精密量取空白溶劑二甲基亞砜5 ml，置頂空瓶中，密封。

2）定位溶液配制 分別取乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮適量，精密稱(chēng)定，分別加入二甲基亞砜溶解并定量稀釋制成1 mg/ml的定位溶液，再分別精密量取5 ml，置頂空瓶中，密封，分別依法測(cè)定。

1.2.4 溶液穩(wěn)定性樣品配制

同時(shí)平行配制6份供試品溶液，置室溫下放置，分別于第1、2、4、6、8、12小時(shí)時(shí)，依法測(cè)定，考察供試品溶液中各溶劑殘留量的變化情況。

1.2.5 線性試驗(yàn)溶液配制

分別用二甲基亞砜稀釋制成含乙醇、異丙醇、乙酸乙酯各5.0 mg/ml、二氯甲烷0.6 mg/ml、四氫呋喃0.72 mg/ml、N，N-二甲基甲酰胺0.88 mg/ml和N-甲基吡咯烷酮10 mg/ml的混合照品儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液1 ml置100 ml、50 ml、20 ml、10 ml量瓶及2 ml至10 ml量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得一系列線性試驗(yàn)溶液。

1.2.6 回收率試驗(yàn)樣品配制

1）混合對(duì)照品溶液的制備 照線性試驗(yàn)溶液配制混合對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液（濃度為限度的10倍），精密量取10 ml、4 ml、6 ml，分別置50 ml、25 ml、25 ml量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液（80%、100%、120%）。

2）混合對(duì)照80%+供試品溶液的制備 取供試品約0.5 g，精密稱(chēng)定，置頂空瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液（80%濃度）5 ml使溶解，密封，作為混合對(duì)照80%+供試品溶液，平行配制3份，依法測(cè)定。100%、120%混合對(duì)照溶液如法配制。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

各峰的保留時(shí)間分別為：乙醇4.640 min、異丙醇5.652 min、二氯甲烷6.121 min、乙酸乙酯8.197 min、四氫呋喃8.480 min、N，N-二甲基甲酰胺14.296 min和N-甲基吡咯烷酮20.694 min（表2）；氣相色譜圖見(jiàn)圖1，溶劑峰和各溶劑之間分離度均符合要求。

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密量混合對(duì)照品溶液5 ml置頂空瓶中，依法測(cè)定，各溶劑峰型良好，分離度均大于1.5，表明該法的專(zhuān)屬性較強(qiáng)。

2.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品溶液殘留溶劑量的絕對(duì)變化量均≤0.02%，測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯變化，供試品溶液在室溫條件下放置12 h保持穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

6份殘留溶劑測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 線性試驗(yàn)

以峰面積A為縱坐標(biāo)，以濃度C（mg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，所得回歸方程（n=6）及線性范圍見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，各溶劑在各自的線性范圍內(nèi)，濃度均與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 檢測(cè)限和定量限

以信噪比約為3時(shí)計(jì)算檢測(cè)限，以信噪比約為10時(shí)計(jì)算定量限，測(cè)得各溶劑的定量限及檢測(cè)限見(jiàn)表4。

2.7 回收率試驗(yàn)

按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果溶劑乙醇、異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮的平均回收率依次為103.4%、104.2%、102.8%、101.0%、99.4%、104.6%、94.3%，回收率在80～120%范圍之內(nèi)；RSD依次為2.52%、3.95%、2.42%、2.78%、2.60%、4.26%、3.54%，小于5%，符合要求（n=9）。

2.8 耐用性試驗(yàn)

分別考察頂空瓶平衡時(shí)間（±5 min）、起始溫度（±5℃）和分流比（±5∶1）等色譜條件的微小變化對(duì)色譜系統(tǒng)適用性和殘留溶劑測(cè)定結(jié)果的變化情況。各條件下各溶劑峰理論塔板數(shù)（>500）、拖尾因子（<3.0）和分離度（>1.5）等均符合要求，殘留溶劑測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯變化，表明本法測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯殘留溶劑耐用性良好。

2.9 樣品測(cè)定

同時(shí)測(cè)定3批樣品，以外標(biāo)法計(jì)算各溶劑含量，二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺及和N-甲基吡咯烷酮均未檢出，各溶劑殘留均低于富馬酸替諾福韋二吡呋酯各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品質(zhì)量合格（表5）。

3 討論

選擇直接進(jìn)樣方式時(shí)，由于進(jìn)樣口溫度較高，而富馬酸替諾福韋二吡呋酯樣品在高溫條件下不穩(wěn)定，易被破壞產(chǎn)生未知峰，且易殘留，基線噪音大，易干擾樣品殘留溶劑測(cè)定；選擇頂空進(jìn)樣方式時(shí)，進(jìn)樣口溫度可設(shè)置為較低溫度，樣品不易被破壞，不會(huì)干擾樣品檢測(cè)，且基線噪音小，故最終選擇頂空進(jìn)樣方式測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯的殘留溶劑。

成品在二甲基亞砜中溶解性較好，且不干擾各溶劑的測(cè)定，但在室溫低于17 ℃左右時(shí)，二甲基亞砜易凝固，因此配制樣品時(shí)應(yīng)注意室溫的影響，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇常規(guī)的平衡溫度為100 ℃，平衡時(shí)間為30 min，在此條件下，樣品頂空進(jìn)樣不會(huì)產(chǎn)生未知干擾峰，測(cè)定結(jié)果可重現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] Deeks SG， Barditch-Crovo P， Collier A， et al. Hydroxyurea does not enhance the anti-HIV activity of low-dose tenofovir disoproxil fumarate[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 28（4）： 336-339.

[2] Barditch-Crovo P， Deeks SG， Collier A， et al. Phase i/ii trial of the pharmacokinetics， safety， and antiretroviral activity of tenofovir disoproxil fumarate in human immunodeficiency virus-infected adults[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 45（10）： 2733-2739.

[3] Fung HB， Stone EA， Piacenti FJ. Tenofovir disoproxil fumarate： a nucleotide reverse transcriptase inhibitor for the treatment of HIV infection[J]. Clin Ther， 2002， 24（40）： 1515-1548.

[4] Ristig MB， Crippin J， Aberg JA， et al. Tenofovir disoproxil fumarate therapy for chronic hepatitis B in human immunodeficiency virus/hepatitis B virus-coinfected individuals for whom interferon-alpha and lamivudine therapy have failed[J]. J Infect Dis， 2002， 186（12）： 1844-1847.

[5] Porche DJ. Tenofovir disoproxil fumarate （Viread）[J]. J Assoc Nurses AIDS Care， 2002， 13（3）： 100-102.

[6] ICH指導(dǎo)委員會(huì). 周海鈞， 譯. 藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求：質(zhì)量部分[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2000.

[7] 孫伶， 劉川. 富馬酸替諾福韋二吡呋酯中殘留溶劑檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證[J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2015， 32（2）： 142-145.

[8] 王兵. 氣相色譜法測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料的殘留溶劑[J]. 廣東化工， 2015， 42（16）： 209.