吳 澎,賈朝爽,+,李向陽,周 濤,范安琪,徐若瀅,唐璐瑩,孫玉剛

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省糧食加工技術(shù)研究中心，山東泰安 271018;2.山東省果樹研究所，山東泰安 271018)

櫻桃(Cerasuspseudocerasus)為薔薇科李屬經(jīng)濟(jì)作物,主要品種有中國櫻桃、歐洲酸櫻桃、歐洲甜櫻桃和毛櫻桃等[1]。櫻桃果實(shí)營養(yǎng)豐富且均衡,含有大量的礦物質(zhì)和維生素,尤其富含花色苷、花青素等多酚類有效成分,這些有效成分對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老、改善睡眠有顯著療效,同時(shí)櫻桃酒酒香濃厚、入口甘甜、口感純正、口味極好,深受大眾的喜愛[2-4]。

櫻桃發(fā)酵果酒中所含的多酚類物質(zhì)對(duì)于所釀櫻桃酒的風(fēng)味、顏色和口感起到?jīng)Q定性的作用[5-7]。多酚不僅具有較強(qiáng)的抗氧化作用,還具有抗輻射、抗癌、抗病毒以及降血壓等作用[8-16]。果酒中測定總酚的方法有鐵氰化鉀分光光度法、福林酚法、高錳酸鉀滴定法等。其中高錳酸鉀滴定法終點(diǎn)較難觀察,靈敏度偏低;鐵氰化鉀分光光度法干擾因素較多,對(duì)測定環(huán)境要求較嚴(yán)格,且測定過程中很容易出現(xiàn)沉淀[17-25];福林酚法干擾因素少、操作簡單、靈敏度較高,準(zhǔn)確度和精密度較好,故其適合一般果酒中總酚的測定,應(yīng)用最為廣泛,但福林酚法測定不同種類果酒中的總酚含量存在一定差異[26]。

據(jù)報(bào)道,總酚物質(zhì)已成為食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[27-30]。近幾年對(duì)葡萄酒、桑葚酒、獼猴桃酒等總酚物質(zhì)有較多的研究,但櫻桃酒中總酚的研究報(bào)道甚少[31-33]。方玲玲等[34]僅對(duì)國產(chǎn)櫻桃酒中總酚的抗氧化性進(jìn)行研究,結(jié)果表明櫻桃酒清除自由基的能力與總酚的含量有關(guān),但針對(duì)福林酚法測定不同品種櫻桃酒中總酚工藝研究未見報(bào)道。本研究采用福林酚法測定櫻桃酒中總酚物質(zhì),以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別研究顯色劑(福林試劑)用量、碳酸鈉用量、碳酸鈉濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度,并通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)等對(duì)福林酚法進(jìn)行全面分析與評(píng)價(jià),確定最佳的工藝條件,以期為進(jìn)一步開發(fā)櫻桃酒提供有效的測試手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫻桃酒 酒精發(fā)酵后未進(jìn)行其他處理,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室釀造[35-36],經(jīng)測定酒精度為12.0%～14.0%,殘?zhí)呛繛?.3 g/L;果膠酶 酶活20000 U/g,南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 天津市百世化工有限公司;福林酚顯色劑(1.0 moL/L) 索萊寶生物科技有限公司(貨號(hào):F8060);無水碳酸鈉(分析純) 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

FA2004型電子分析天平 上海精天電子儀器廠有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;UV-8000紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 福林酚試劑用量的確定 取6份1 mL櫻桃酒樣品,分別加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL福林酚試劑,混勻靜置30 s后8 min內(nèi)加入200 g/L碳酸鈉溶液8.0 mL,定容至25 mL,搖勻置于25 ℃水浴中,避光顯色2 h,在760 nm處測定吸光度,得到最佳顯色劑用量,平行測定3次。

1.2.1.2 碳酸鈉用量的確定 取5份1 mL櫻桃酒樣品,加入2.0 mL福林酚試劑,混勻靜置30 s后8 min內(nèi)，分別加入200 g/L碳酸鈉溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,定容至25 mL,搖勻置于25 ℃水浴中,避光顯色2 h,在760 nm處測定吸光度,得到最佳碳酸鈉用量,平行測定3次。

1.2.1.3 碳酸鈉濃度的確定 取6份1 mL櫻桃酒樣品,加入2.0 mL福林酚試劑,混勻靜置30 s后8 min內(nèi)分別加入20、40、60、80、100、200 g/L碳酸鈉溶液8.0 mL,定容至25 mL,搖勻置于25 ℃水浴中,避光顯色2 h,在760 nm處測定吸光度,得到最佳碳酸鈉濃度,平行測定3次。

1.2.1.4 顯色時(shí)間的確定 取6份1 mL櫻桃酒樣品,加入2.0 mL福林酚試劑,混勻靜置30 s后8 min內(nèi)加入60 g/L碳酸鈉溶液8.0 mL,定容至25 mL,搖勻置于25 ℃水浴中,分別避光顯色0、0.5、1.0、1.5、2.0 h,在760 nm處測定吸光度,得到最佳顯色時(shí)間,平行測定3次。

1.2.1.5 顯色溫度的確定 取5份1 mL櫻桃酒樣品,加入2.0 mL福林酚試劑,混勻靜置30 s后8 min內(nèi)加入60 g/L碳酸鈉溶液8.0 mL,定容至25 mL,搖勻分別置于20、25、30、35、40 ℃水浴中,避光顯色1.5 h,在760 nm處測定吸光度,得到最佳顯色溫度,平行測定3次。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以總酚含量為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面分析法進(jìn)行五因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels table used in response surface experiment

1.2.3 總酚含量的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于100 mL容量瓶中,用去離子水定容至刻度,制成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL,隨后加入櫻桃酒樣品1 mL、福林酚試劑2.0 mL,60 g/L的碳酸鈉溶液8.0 mL,用去離子水定容至25 mL,混勻,在25 ℃水浴中,避光放置1.5 h,用空白管調(diào)零,于760 nm處測定吸光度值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.117x+0.0065,式中:y為吸光度,x為沒食子酸含量,g;相關(guān)系數(shù)R2=0.9994[37]。

1.2.3.2 樣品總酚含量的測定 采用福林酚法,取1.0 mL澄清的櫻桃酒,加去離子水至10 mL,精確量取稀釋樣品1 mL,采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同的方法測定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量,其計(jì)算公式如下:

W=CV×N/m

式中:W為櫻桃酒總酚含量,mg/L;C為櫻桃酒總酚質(zhì)量濃度,mg/L;V為測定液體積,mL;m為櫻桃酒體積,mL;N為稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Originpro 9.1軟件和Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后,使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,顯著性水平為p<0.05,極顯著性水平為p<0.01。同時(shí)采用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 福林酚試劑用量的確定 福林酚試劑用量對(duì)底物的顯色有直接影響[38-39]。從圖1可以看出,隨著福林酚試劑用量的增加,吸光度呈增加趨勢(p<0.05),當(dāng)用量為2.0 mL時(shí),吸光度值達(dá)到最大,再增加福林酚試劑用量,吸光度值出現(xiàn)略微下降且呈現(xiàn)淡綠色,這可能是由于顯色劑過量后,呈現(xiàn)出顯色劑本身的顏色[40]。因此從經(jīng)濟(jì)角度選擇2.0 mL為最佳用量。

圖1 福林酚試劑用量對(duì)吸光度值的影響Fig.1 Effect of Folin-Ciocalteu reagent amount on the absorbance value

2.1.2 碳酸鈉用量的確定 從圖2可以看出,隨著碳酸鈉用量的增加,吸光度值先增加后減少,在碳酸鈉用量為8 mL時(shí),吸光度值達(dá)到最大,隨后迅速降低,這可能是由于此時(shí)碳酸鈉溶液大量析出晶體,使吸光度值迅速降低[41]。因此,選擇碳酸鈉用量為8.0 mL為最優(yōu)用量。

圖2 碳酸鈉用量對(duì)吸光度值的影響Fig.2 Effect of of sodium carbonate on absorbence value

2.1.3 碳酸鈉濃度的確定 從圖3可以看出,吸光度值對(duì)碳酸鈉濃度依賴性較大,隨著碳酸鈉濃度的增加,吸光度值顯著增加(p<0.05);在碳酸鈉濃度為60 g/L時(shí),吸光度值達(dá)到最大值,隨后吸光度值顯著降低。說明碳酸鈉濃度達(dá)到60 g/L后,顯色反應(yīng)才較為完全,所以選擇碳酸鈉濃度為60 g/L為最適濃度。

圖3 碳酸鈉濃度對(duì)吸光度值的影響Fig.3 Effect of carbonate solution mass concentration on absorbance value

2.1.4 顯色時(shí)間的確定 從圖4可以看出,隨顯色時(shí)間的延長(0～1.5 h),櫻桃酒總酚的吸光度值呈顯著增加趨勢(p<0.05)。當(dāng)顯色時(shí)間為1.5 h時(shí),吸光度值最大,之后隨著時(shí)間的增加吸光度值略有波動(dòng),但基本變化不大,因此選擇1.5 h為最佳顯色時(shí)間。

圖4 顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.4 Effect of coloration time on absorbance value

2.1.5 顯色溫度的確定 溫度的高低不僅會(huì)影響到總酚物質(zhì)的穩(wěn)定性,而且會(huì)對(duì)總酚物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[42]。從圖5可以看出,在顯色溫度低于25 ℃時(shí),隨著溫度的升高吸光度值逐步增大,25～35 ℃時(shí),隨著溫度的增加,吸光度呈較小的趨勢(p<0.05),可能是隨溫度的升高有色物質(zhì)被逐漸分解[41]。當(dāng)25 ℃時(shí)吸光度值達(dá)到最大,因此選擇25 ℃為最佳顯色溫度。

圖5 顯色溫度對(duì)吸光度值的影響Fig.5 Effect of coloration temperature on absorbance value

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合,得到總酚含量對(duì)福林酚試劑用量(A)、碳酸鈉濃度(B)、顯色溫度(C)、顯色時(shí)間(D)、碳酸鈉用量(E)的回歸模型方程為:總酚含量Y(mg/L)=1078.67+20.06A+26.06B+12.56C-25.19D+29.38E+97.25AB-58.25AC-14.25AD-25.00AE+62.50BC-19.25BD-33.25BE+4.75CD-24.25CE-49.50DE-79.81A2-154.31B2-115.65C2-101.31D2-87.90E2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results for response surface experiment

從表3方差分析可以看出,該模型的p值小于0.0001,具有高度的顯著性。失擬項(xiàng)p值為0.2594,表明失擬項(xiàng)不顯著,其校正決定系數(shù)R2=0.9101,表明此模型擬合度好,實(shí)驗(yàn)誤差小,因此該模型能夠反映響應(yīng)面的變化,可以較好地描述本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)可知,一次項(xiàng)E,交互項(xiàng)AB、AC、BC,二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2均極顯著(p<0.01),一次項(xiàng)B、D,交互項(xiàng)DE,均顯著(p<0.05),其他因素影響不顯著(p>0.05)。根據(jù)F值可知,實(shí)驗(yàn)因素對(duì)總酚含量的影響依次為:碳酸鈉溶液用量(E)>碳酸鈉濃度(B)>顯色時(shí)間(D)>福林酚試劑用量(A)>顯色溫度(C)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化 各個(gè)因素之間的相互關(guān)系以及相互作用程度可以通過響應(yīng)面圖進(jìn)行反映[43-45]。通過觀察圖6中響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度,可以更加直觀清晰地觀察兩因素之間關(guān)系,當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形且坡度較平緩時(shí),表示兩因素交互作用不顯著,呈橢圓形且坡度較陡時(shí),表示兩因素交互作用影響顯著[46-47]。

圖6 各因素交互作用對(duì)總酚含量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction parameters on polyphenal yield

由圖6a可知,碳酸鈉濃度的變化曲面比福林酚試劑用量的變化曲面陡峭,說明碳酸鈉濃度對(duì)總酚含量的影響更顯著一些,與方差分析結(jié)果相符。由圖6b可知,福林酚試劑用量的變化曲面較陡峭,相比之下,顯色溫度的變化曲面平緩一些,說明福林酚試劑用量較顯色溫度對(duì)總酚含量的影響大,與方差分析結(jié)果相符。由圖6c可知,碳酸鈉濃度的變化曲面比顯色溫度的變化曲面陡峭,說明碳酸鈉濃度對(duì)總酚含量的影響更顯著一些,與方差分析結(jié)果相符。由圖6d可知,碳酸鈉用量的變化曲面和顯色時(shí)間的變化曲面均較陡峭,說明碳酸鈉用量和顯色時(shí)間對(duì)櫻桃酒總酚含量影響均較顯著,與方差分析結(jié)果相符。圖6等高線圖均呈明顯的橢圓形,說明福林酚試劑用量和碳酸鈉濃度、福林酚試劑用量和顯色溫度、碳酸鈉濃度和顯色溫度、顯色時(shí)間和碳酸鈉用量之間交互作用均較為顯著,對(duì)總酚含量影響較大。

2.2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證 通過響應(yīng)面法得到測定總酚的最佳條件為:福林酚試劑用量為2.1 mL、碳酸鈉濃度為62.92 g/L、顯色溫度為25.12 ℃、顯色時(shí)間為1.4 h、碳酸鈉用量為8.32 mL,在此條件下總酚含量為1087.48 mg/L。參照理論上的最佳工藝條件,實(shí)際操作中稍作調(diào)整:福林酚試劑用量為2.1 mL、碳酸鈉濃度為63 g/L、顯色溫度為25 ℃、顯色時(shí)間為1.4 h、碳酸鈉用量為8.32 mL,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為(1085.2±0.16) mg/L,雖然略微小于表3中的最高值,但與理論值非常接近,說明此實(shí)驗(yàn)條件可靠。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取櫻桃酒樣1 mL,按上述最優(yōu)條件進(jìn)行處理及測定方法,反應(yīng)1.4 h后,于室溫下分別放置0、2、4、6、8、10 h,于760 nm波長處測定吸光度值,并計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。吸光度值依次為0.5498、0.5379、0.5375、0.5365、0.5359、0.5352。當(dāng)其放置時(shí)間超過2 h后,吸光度值有略微減小的趨勢,但變化不明顯,基本上處于穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)果表明,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%,說明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取6份櫻桃酒樣各1 mL,按上述最優(yōu)條件進(jìn)行處理及測定方法,分別測定其總酚含量,并計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.25%、8.35%、7.98%、7.88%、8.28%、8.14%。結(jié)果表明,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.25%,說明該方法重復(fù)性較好。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 采用福林酚法對(duì)同一櫻桃酒樣品1 mL按照確定的最佳方法進(jìn)行6次平行測定,并計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。櫻桃酒中總酚的含量分別為1031、1032、1049、1021、1040、1048 μg/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%,說明該方法的精密度高,能夠滿足樣品分析的要求。

2.3.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 在1 mL櫻桃酒樣品中加入濃度分別為50、100、150、200、250、300 ug/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別測定其總酚含量并計(jì)算回收率。由表4可知,6次加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的最高回收率為106%,最低回收率為97%,平均回收率為100.04%,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.09%。以上結(jié)果表明該分析方法準(zhǔn)確可靠,可用于櫻桃酒中總酚含量的測定。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of recovery rate experiment

2.4 不同品種櫻桃酒總酚含量測定

由表5可知,不同品種櫻桃酒中總酚含量不同,俄羅斯酸櫻桃的總酚含量最高,為1495.0 mg·L-1,其他品種總酚含量按照由高到低順序依次為黑珍珠、H-8、H-2、秦林、美早、H-3、Sir、早紅珠、Red、H-4,雷尼最低(442.8 mg·L-1),僅為俄羅斯酸櫻桃總酚含量的1/3,櫻桃酒總酚平均含量為876.9 mg·L-1,高于方玲玲等[34]測定不同品種櫻桃酒的總酚含量(平均為309 mg·L-1),這可能與品種、基因型、地域和農(nóng)藝條件有關(guān)。

表5 櫻桃酒總酚含量測定結(jié)果Table 5 Results of the polyphenols contents in cherry wine

3 結(jié)論

采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化櫻桃酒中多酚含量的測定工藝,最佳工藝條件為:福林酚試劑用量2.1 mL、碳酸鈉濃度63 g/L、顯色溫度25 ℃、顯色時(shí)間1.4 h、碳酸鈉用量8.32 mL,在此條件下總酚含量為1085.2±0.16 mg/L,與預(yù)測結(jié)果相吻合,為福林酚法測定櫻桃酒總酚含量提供了理論依據(jù)。根據(jù)線性回歸方程測定櫻桃酒總酚含量的方法具有所需時(shí)間短、試劑用量少、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、精密度高且對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn),可為櫻桃酒中總酚的檢測提供較為準(zhǔn)確可靠的方法。通過對(duì)12種櫻桃酒中總酚含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)俄羅斯酸櫻桃酒中總酚含量最高,可達(dá)1495.0 mg/L,雷尼櫻桃酒含量最低,總酚含量僅有442.8 mg/L,為開發(fā)利用櫻桃新品種提供參考依據(jù)。