李丹丹,馬 英,柏 韻,張立斌,張 肖,張 振,2,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110868)

殼寡糖是由甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物殼聚糖經(jīng)過降解而得的聚合度為2～10的低分子聚合物。具有水溶性[1-2]、提高機(jī)體免疫力、抗感染、抗菌作用、抗癌,抗腫瘤等功效[3-4]。殼寡糖在目前的制備方法主要有化學(xué)降解法、酶解法、物理法等[5]?；瘜W(xué)降解法主要是采用合適化學(xué)方法對(duì)殼聚糖進(jìn)行有限降解而得到殼寡糖[6]。該法操作簡(jiǎn)單,但降解產(chǎn)物質(zhì)量分布寬,分離純化降解產(chǎn)物有一定難度,消耗試劑大和后處理較復(fù)雜[6]。如劉琳等[7]從過氧化氫制備聚合度為6～8的殼寡糖的研究工藝中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物得率提高,達(dá)到62.17%,且平均聚合度為6.87。鄭必勝等[8]發(fā)現(xiàn)殼聚糖在過氧化氫降解的工藝中,最優(yōu)條件下完全降解且平均相對(duì)分子質(zhì)量在2000以下,結(jié)構(gòu)單元聚合度在10以下。物理法不易引入雜質(zhì)、易于控制、污染小,但產(chǎn)物分子量分布寬、得率低。丁盈紅等[9]利用微波輻射快速制備水溶性殼聚糖,設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)法,得到最優(yōu)化反應(yīng)條件,顯示320 W時(shí)輻射4 min和560 W時(shí)輻射2 min制備水溶性殼聚糖效果亦相當(dāng)不錯(cuò)。與前幾種相比,酶解法具有無污染、產(chǎn)物得率高、產(chǎn)品均一性好等優(yōu)點(diǎn),因此,酶解法降解殼聚糖是近年研究的重點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)將物理法與酶法相結(jié)合,采用微波輔助酶法制備殼寡糖,并利用響應(yīng)面得到最佳工藝條件,以期為殼寡糖的制備提供一種新型有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖脫乙酰度80%～95% 生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;果膠酶3000 U/mL生物試劑山東棗莊杰諾生物酶有限公司;無水亞硫酸鈉 天津虔誠(chéng)偉業(yè)科技發(fā)展有限公司;無水乙酸鈉、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、冰乙酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;3,5-二硝基水楊酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠;葡萄糖 天津市津北精細(xì)化工有限公司;苯酚 沈陽市新化試劑廠;其他試劑 均為分析純。

722s可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;電磁爐 九陽股份有限公司;M1-203A型微波爐 廣東美的廚房電器制造有限公司;DU-65D高精度水浴槽、恒溫水浴鍋、電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶活力的測(cè)定 果膠酶水解果膠生成的半乳糖醛酸具有還原性糖醛基,可用次亞碘酸法定量測(cè)定,以此表示果膠酶的活性[10]。1 mL酶液在50 ℃,pH為3.5的條件下,1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸定義為一個(gè)酶活單位。實(shí)驗(yàn)所用果膠酶酶活為3000 U/mL。

1.2.2 殼寡糖的制備 準(zhǔn)確稱取0.1 g殼聚糖,溶解于一定體積0.2 mol/L不同pH的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中,配制成濃度2%(w/v)的膠體溶液,加入一定量的果膠酶,分別在不同微波功率、不同反應(yīng)溫度下反應(yīng)1 h,隨后煮沸10 min滅酶活,過濾。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 微波功率對(duì)微波輔助酶法制備殼寡糖的影響 在反應(yīng)溫度為50 ℃、酶用量2000 U/g、pH為4.4、輻射時(shí)間2 min條件下,考察微波功率分別為100、300、500、700、900 W時(shí)樣品中還原糖含量。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)微波輔助酶法制備殼寡糖的影響 在微波功率500 W、酶用量2000 U/g、pH為4.4、輻射時(shí)間2 min條件下,考察反應(yīng)溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時(shí)樣品中還原糖含量。

1.2.3.3 pH對(duì)微波輔助酶法制備殼寡糖的影響 在反應(yīng)溫度為50 ℃、微波功率為500 W、加酶量2000 U/g、輻射時(shí)間2 min條件下,考察pH為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2時(shí)樣品中還原糖含量。

1.2.3.4 加酶量對(duì)微波輔助酶法制備殼寡糖的影響 在反應(yīng)溫度為50 ℃、微波功率為500 W、pH為4.4、輻射時(shí)間2 min條件下,考察加酶量分別為800、1200、1600、2000、2400 U/g時(shí)樣品中還原糖含量。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 為優(yōu)化微波輔助酶法制備殼聚糖工藝,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇加酶量、pH、微波功率為自變量,還原糖濃度為Y值,運(yùn)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn),分析各自變量及其交互作用對(duì)還原糖濃度的影響。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface experiment factor level design

1.2.5 還原糖含量的測(cè)定 用DNS法[11]擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.9422x(R2=0.9941),說明方程擬合度較好[12]。利用比色法測(cè)定樣品中的含糖量[13-14]。先取樣品液適當(dāng)稀釋,使糖濃度為0.1～1.0 mg/mL,再量取稀釋后的糖液1 mL于15 mL試管中,準(zhǔn)確加入2 mL DNS試劑,置于沸水浴中煮沸2 min,以流水迅速冷卻,用水定容至15 mL試管中,搖勻。在459 nm處測(cè)定吸光度,與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線作對(duì)照,即可計(jì)算出樣品中還原糖含量(mg/mL)。

1.2.6 所得殼寡糖平均分子量測(cè)定 采用端基分析法表征殼聚糖降解程度[15-17]。殼聚糖三次完全降解測(cè)定的平均值A(chǔ)0。每次實(shí)驗(yàn)中殼聚糖降解之后檢測(cè)得的還原端基數(shù)值為A1,殼聚糖的平均聚合度估算公式為:DP=A0/A1,并按下式計(jì)算平均分子量:Mn=179DP-18(DP-1)

1.2.7 微波輔助酶法制備殼寡糖工藝與常規(guī)酶解方法的比較 在加酶量2100 U/g,微波功率510 W,pH4.4,反應(yīng)溫度50 ℃條件下分別采用微波輔助酶法,微波降解法和常規(guī)酶法進(jìn)行制備殼寡糖效果比較,驗(yàn)證微波輔助酶法制備殼寡糖工藝的優(yōu)點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,采用Excel進(jìn)行繪圖,利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析,當(dāng)p<0.01為差異極顯著,0.010.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對(duì)殼聚糖酶解效果的影響 由圖1可知,隨著微波功率的增大,還原糖含量先增加后減少,說明微波對(duì)果膠酶的酶活在一定的范圍內(nèi)具有促進(jìn)作用。當(dāng)微波功率設(shè)定為500 W時(shí),還原糖含量最高,因此,選定微波功率為500 W。

圖1 微波功率對(duì)殼寡糖制備的影響Fig.1 Effect of microwave power on reducing sugar content

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)殼聚糖酶解效果的影響 酶對(duì)溫度具有極高敏感性,反應(yīng)溫度對(duì)酶反應(yīng)速率有很大影響。當(dāng)反應(yīng)體系中其他條件不變,僅反應(yīng)溫度改變時(shí),果膠酶在不同反應(yīng)溫度下水解殼聚糖的效果如圖2所示。從圖中可知,還原糖含量隨著溫度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在40～50 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,還原糖含量逐漸上升,50 ℃時(shí)還原糖含量最高,當(dāng)超過55 ℃,還原糖含量開始下降。說明溫度在50 ℃左右的范圍內(nèi),可以達(dá)到較好的酶解效果?？赡艿脑蚴请S著溫度的升高,反應(yīng)物的能量增加,分子間碰撞的頻率也增加,從而提高酶解速率,但是當(dāng)溫度過高,超過了酶的最適溫度時(shí),酶活性將降低,導(dǎo)致水解速度下降。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)殼寡糖制備的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on reducing sugar content

2.1.3 反應(yīng)體系pH對(duì)殼聚糖酶解效果的影響 當(dāng)反應(yīng)體系中其他反應(yīng)條件不變,僅反應(yīng)pH改變時(shí),果膠酶在不同pH條件下水解殼聚糖的效果變化圖如圖3所示,從圖中可知反應(yīng)體系pH對(duì)酶解效果有顯著影響。產(chǎn)物中還原糖含量隨著pH的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH處于3.6～4.4范圍內(nèi),隨著pH升高,還原糖含量逐漸上升,當(dāng)pH超過4.4之后,還原糖含量開始下降,因此,最佳pH為4.4。

圖3 pH對(duì)殼寡糖制備的影響Fig.3 Effect of pH on reducing sugar content

2.1.4 加酶量對(duì)殼聚糖酶解效果的影響 從圖4中可以看出,加酶量從800 U/g上升至2000 U/g時(shí),還原糖含量緩慢上升,當(dāng)加酶量大于2000 U/g時(shí),還原糖含量小幅下降,說明加酶量對(duì)殼聚糖的酶解效果有一定的影響。在加酶量達(dá)到酶解飽和濃度之前,殼聚糖的酶解效果隨著果膠酶用量而增強(qiáng),但當(dāng)加酶量達(dá)到飽和后,酶解反應(yīng)趨于穩(wěn)定,增大加酶量亦難提高還原糖含量,因此,果膠酶最佳用量為2000 U/g。

圖4 酶用量對(duì)還原糖含量的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on reducing sugar content

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn),影響反應(yīng)結(jié)果的因素按作用效果排序依次為pH>酶用量>微波功率>反應(yīng)溫度[18],因此選擇加酶量、pH、微波功率,3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),以還原糖含量(Y)為響應(yīng)值,響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2,對(duì)表2進(jìn)行回歸分析,得到回歸方程:Y=1.96+0.041A+0.022B+0.025C-0.043AB+0.042AC+0.026 BC-0.08A2-0.12B2-0.13C2

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of the Box-Behnken test

2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

表3 Box-Behnken回歸方程方差分析Table 3 Box-Behnken regression analysis of variance

由圖5可知,加酶量、pH、微波功率三個(gè)因素之間存在交互作用。圖5(a)為加酶量和pH之間相互作用的效果,可知:還原糖含量隨著加酶量和pH的增加先增加后降低,有明顯的最大值。增加加酶量可以提高殼聚糖的酶解率,反應(yīng)越完全,pH的變化則影響果膠酶的活性。圖5(b)為微波功率和加酶量之間作用的影響,微波功率較低時(shí),蛋白質(zhì)濃度隨著加酶量的增加而增加,提高微波功率,分子間運(yùn)動(dòng)加快,當(dāng)功率過高時(shí),果膠酶的活性受到影響,還原糖含量減少。圖5(c)為微波功率和pH之間相互作用的效果,隨著兩者的增加,還原糖含量同樣呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),曲面明顯,有明顯的峰值,兩者之間存在相互作用。

圖5 三種因素相互作用響應(yīng)曲線面Fig.5 Response surface of three-factor interaction

2.3.1 微波輔助酶法制備殼寡糖的最佳工藝條件確定 通過軟件Design-ExpertV8.0.6求解方程,得到微波輔助酶法制備殼寡糖最佳提取工藝條件為:加酶量2096.93 U/g、pH4.42、微波功率512.12 W、在上述條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的還原糖含量為1.9688 mg/mL。為了檢測(cè)模型可行性,結(jié)合具體自身實(shí)際情況,在加酶量2100 U/g、pH4.4、微波功率510 W、反應(yīng)溫度50 ℃條件下,經(jīng)過三次重復(fù)試驗(yàn),得到樣品中還原糖含量平均值為1.964±0.011 mg/mL,與預(yù)測(cè)值結(jié)果相近(RSD=0.0065),模型可靠。

2.3.2 殼寡糖平均分子量 采用端基分析法表征殼聚糖降解程度,A0=3.38 mmol/g,A1=0.658 mmol/g,平均聚合DP=5.14,殼寡糖平均分子量Mn=845.54。舒德海[19]利用氧化法預(yù)處理酶法制備的殼寡糖平均分力量為Mn=917.68,劉琳[7]用過氧化氫法制備的特定聚合度殼寡糖平均分子量為Mn=907.15,本實(shí)驗(yàn)所得殼聚糖平均分子量稍低。

2.3.3 不同方法制備殼寡糖產(chǎn)率的比較 每種方法制備均做3次平行試驗(yàn)取平均值,對(duì)不同方法制備甲殼低聚糖的效果進(jìn)行比較,結(jié)果如表4所示。

由表4可知,微波輔助果膠酶制備殼寡糖,與單一果膠酶酶解法(1.747 mg/mL)相比提高了12%,與單一微波法(1.671 mg/mL)相比提高了18%,同時(shí)采用微波輔助酶法降解殼聚糖,能夠大大節(jié)省單純酶解時(shí)間,因此有著明顯的成本優(yōu)勢(shì)。

表4 不同制備方法還原糖含量的比較Table 4 Comparison of reducing sugar content of different preparation methods

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了果膠酶酶用量,酶解溫度,反應(yīng)體系pH,微波功率對(duì)殼寡糖產(chǎn)率的影響,并采用了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了最佳工藝,所得最佳制備條件為:果膠酶加酶量為2100 U/g,酶解溫度為50 ℃,反應(yīng)體系pH為4.4,微波功率510 W輻射2 min。此條件下微波輔助酶法制備殼寡糖所得殼寡糖的得率均高于單一酶法制備和單一物理法制備。因此,相比單一制備殼寡糖的方法,本實(shí)驗(yàn)采用物理法與酶法相結(jié)合的方法對(duì)殼寡糖制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,為獲得最佳的殼寡糖制備工藝及其工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù),并驗(yàn)證了其優(yōu)點(diǎn):微波輔助果膠酶制備殼寡糖,與單純微波法和酶法降解相比,有較高的產(chǎn)率,同時(shí)采用微波輔助酶法降解殼聚糖,能夠大大節(jié)省單純酶解時(shí)間,因此有著明顯的成本優(yōu)勢(shì)。