藍(lán)尉冰,徐開(kāi)平,韓 鑫,陳美花

(1.欽州學(xué)院,廣西欽州 535099; 2.廣西大學(xué),廣西南寧 530004; 3.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開(kāi)發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535099)

甲殼素又稱幾丁質(zhì),屬于天然高分子,其用途廣泛,可用于食品、化學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域。甲殼素來(lái)源廣泛,主要存在于蝦、蟹殼等甲殼生物。南美白對(duì)蝦(PenaeusvannameiBoone),原產(chǎn)地為美國(guó)南部的太平洋海岸,后逐漸引入中國(guó)并大量養(yǎng)殖。目前,南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖在我國(guó)得到了一定程度的發(fā)展,但我國(guó)對(duì)蝦除鮮蝦銷售外,大部分被加工成冷凍蝦仁出口,造成大量蝦類廢棄物[1]。因此,蝦類廢棄物的綜合利用成為水產(chǎn)品加工熱點(diǎn)之一。

近年來(lái),我國(guó)對(duì)蝦頭、蝦殼等廢棄物利用已引起重視,但仍處在起步階段。傳統(tǒng)蝦廢棄物主要被加工成飼料,其經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值低。南美白對(duì)蝦蝦頭、蝦殼含大量甲殼素[2],是生產(chǎn)甲殼素的良好原料。目前以蝦頭蝦殼為原料獲得甲殼素,已引起越來(lái)越多的學(xué)者與企業(yè)家的重視。國(guó)內(nèi)外甲殼素制備方法主要有酶法[3]、發(fā)酵法[4]、化學(xué)改良法[5]、傳統(tǒng)酸堿法等。酶法存在耗時(shí)長(zhǎng)、不可循環(huán)利用等問(wèn)題;發(fā)酵法操作復(fù)雜、生產(chǎn)條件嚴(yán)格且周期長(zhǎng);化學(xué)改良法工藝條件不完善,存在堿性較強(qiáng)等問(wèn)題;傳統(tǒng)酸堿法能耗高、耗時(shí)、耗力,且環(huán)境污染較嚴(yán)重。故尋求一種省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的甲殼素制備技術(shù)迫在眉睫。

微波技術(shù)是一門(mén)綠色環(huán)保技術(shù),其主要原理是中粒子在微波磁場(chǎng)中會(huì)因微波頻率的提高而急速更改方向,使分子間發(fā)生撞擊現(xiàn)象,產(chǎn)生大量熱量從而讓溫度迅速升高[6],使固體樣品表面迅速裂解,并能夠在數(shù)分鐘內(nèi)完全分解。微波技術(shù)相比其他方法,具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。目前,利用微波技術(shù)制備廣西北部灣地區(qū)南美白對(duì)蝦甲殼素未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)酸堿法的基礎(chǔ)上,采用微波輔助法制備南美白對(duì)蝦蝦頭、蝦殼中的甲殼素,通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)進(jìn)行脫蛋白及脫鈣,探討微波輔助法制備甲殼素的最佳工藝條件。以期為我國(guó)蝦頭、蝦殼等廢棄物甲殼素的制取提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ),為水產(chǎn)品高值化利用提供技術(shù)支持,以此帶動(dòng)廣西北部灣經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對(duì)蝦 欽州市東風(fēng)市場(chǎng),洗凈后取蝦頭、蝦殼經(jīng)60 ℃烘10 h烘干、粉碎,過(guò)60目篩備用;95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸 分析純,成都市科隆化工試劑廠;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、考馬斯亮藍(lán)G-250 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鉻黑T 分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;標(biāo)準(zhǔn)蛋白 碧云天生物技術(shù)有限公司。

FA2004電子分析天平 上海耀杰有限公司;ZRD-A5110全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司;G80D23CN2P-T7(B0)微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;V-1800PC可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;SZ-500A-3超高速多功能粉碎機(jī) 永康市善竹貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝦頭、蝦殼中甲殼素的制備工藝流程

1.2.1.1 傳統(tǒng)酸堿法制備蝦頭、蝦殼中甲殼素 稱取2.00 g預(yù)處理樣品，調(diào)整料液比為1∶25 g/mL，打漿后置于250 mL燒杯中，加入5.2 g NaOH，使其最終濃度為10%(w/w)，100 ℃水浴恒溫1.5 h后，抽濾得到脫蛋白后的蝦殼，用超純水洗滌至中性，得到脫蛋白殘?jiān)?，測(cè)定其蛋白含量，并計(jì)算脫蛋白率。然后向已脫蛋白殘?jiān)?，?%(w/w) 加入HCl溶液，常溫浸泡8 h，超純水洗滌至中性，測(cè)定其含鈣量，并計(jì)算脫鈣率。用10% H2O2溶液常溫脫色1 h，抽濾，60 ℃烘干即得甲殼素[7]，并計(jì)算甲殼素得率。

1.2.1.2 微波輔助法制備蝦頭、蝦殼中甲殼素 稱取2.00 g預(yù)處理樣品,按照一定料液比加入一定的水打漿,后于250 mL燒杯中,加入一定量的NaOH溶液混勻后,在一定的微波功率和時(shí)間下進(jìn)行處理。后用超純水洗滌至中性,抽濾,60 ℃烘10 h,稱量,取濾液在波長(zhǎng)595 nm條件下進(jìn)行吸光度的測(cè)定,計(jì)算蛋白含量[8]。取已脫蛋白的殘?jiān)匆欢ū壤?加入11.7 mol/L HCl溶液攪拌均勻后,在一定功率及時(shí)間下進(jìn)行微波處理。后超純水洗滌至中性,抽濾,60 ℃烘10 h,稱量,取濾液進(jìn)行EDTA滴定,計(jì)算鈣含量。最后,用10% H2O2對(duì)已脫蛋白脫鈣的濾渣進(jìn)行脫色處理2.0 h,抽濾,60 ℃烘干即得甲殼素[9]。

1.2.2 微波輔助法脫蛋白的工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2的操作進(jìn)行。固定微波時(shí)間為5 min,NaOH濃度5%,料液比1∶25 g/mL,考察微波功率(160、240、320、400、480 W)對(duì)脫蛋白率的影響;固定微波功率240 W,NaOH濃度5%,料液比1∶25 g/mL,考察微波時(shí)間(3、5、7、9、11 min)對(duì)脫蛋白率的影響;固定微波功率240 W,微波時(shí)間5 min,料液比1∶25 g/mL,考察NaOH濃度(2%、4%、6%、8%、10%)對(duì)脫蛋白率的影響;固定微波功率240 W,微波時(shí)間5 min,NaOH濃度6%,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)脫蛋白率的影響。

1.2.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)蝦頭、蝦殼微波輔助法脫蛋白的最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化,正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 微波輔助法脫蛋白的正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test for deproteinization by microwave assisted method

1.2.3 微波輔助法脫鈣的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2的操作進(jìn)行,在脫蛋白率正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行脫鈣單因素實(shí)驗(yàn)。固定微波時(shí)間4 min,HCl濃度3%,料液比1∶30 g/mL,考察微波功率(160、240、320、400、480 W)對(duì)脫鈣率的影響;固定微波功率240 W,HCl濃度3%,料液比1∶30 g/mL,考察微波時(shí)間(2、3、4、5、6 min)對(duì)脫鈣率的影響;固定微波功率為240 W,微波時(shí)間4 min,料液比1∶30 g/mL,考察HCl濃度(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)脫鈣率的影響;固定微波功率240 W,微波時(shí)間4 min,HCl濃度4%,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對(duì)脫鈣率的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平,按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)蝦頭、蝦殼中鈣的不同脫除效果最佳工藝研究,正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2所示。

表2 脫鈣率的正交試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Orthogonal test factors and level table for decalcification rate

1.2.4 微波輔助法與傳統(tǒng)酸堿法對(duì)比 在微波輔助法脫蛋白、脫鈣的最優(yōu)工藝條件下，制備甲殼素，分別測(cè)定脫蛋白率、脫鈣率及甲殼素得率。后與1.2.1.1中傳統(tǒng)工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.5.1 脫蛋白率的測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。根據(jù)試驗(yàn)溶液按表3將配制好的各試管溶液在595 nm波長(zhǎng)下比色,記錄每根管所得的吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量作為橫坐標(biāo),取吸光度作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0051x+0.0032,相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑添加表Table 3 Reagent addition of standard curve

取0.10 mL經(jīng)微波輔助脫除蛋白質(zhì)后的濾液于試管中,加入蒸餾水0.90 mL和考馬斯亮藍(lán)試劑5.00 mL,在595 nm測(cè)吸光度值[10],通過(guò)吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度曲線求出蛋白含量。其中蛋白質(zhì)含量記為X(μg),預(yù)處理樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)記為X1(%),提取液總體積記為V1(mL),測(cè)定時(shí)取用提取液體積記為V0(mL),預(yù)處理樣品的質(zhì)量記為m0(g)。脫蛋白率α計(jì)算公式:

式(1)

1.2.5.2 脫鈣率的測(cè)定 取脫鈣后的濾液2.50 mL,加入5.00 mL蒸餾水和1.00 mL10% NaOH溶液,加入幾滴K-B指示劑,搖勻,用EDTA溶液進(jìn)行滴定。溶液從紫紅色到藍(lán)色時(shí)即為滴定終點(diǎn),記錄消耗的EDTA體積[11]。其中滴定時(shí)取用提取液體積記為V(mL),提取液總體積為V2(mL);滴定消耗的體積記為VEDTA(M1);EDTA濃度記為CEDTA(mol/L);鈣的摩爾質(zhì)量記為Mca(g/mol);脫蛋白后樣品的質(zhì)量記為m(g);脫蛋白后樣品中鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)記為X2(%)。脫鈣率計(jì)算公式如下:

式(2)

1.2.5.3 甲殼素得率的測(cè)定

式(3)

式(3)中,m:脫蛋白、脫鈣后所得的甲殼素的質(zhì)量(g);m0:預(yù)處理樣品的質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Design-Expert 8.0.5b軟件和origin 8.0軟件處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫蛋白工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 微波功率對(duì)脫蛋白率的影響 由圖1可知,在微波功率為160～240 W時(shí),脫蛋白率隨功率增大而增大;微波功率為240 W時(shí),達(dá)最大值為62.3%?？赡苁且?yàn)?在一定微波時(shí)間內(nèi),微波功率越高,系統(tǒng)可以攝取更多的微波能,升溫加快,對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)的破壞作用較大,有利于蝦殼中蛋白質(zhì)成分的浸出[12]。隨后微波功率高于240 W時(shí),脫蛋白率隨微波功率增大而減小,可能是因?yàn)?微波功率太高,快速加熱會(huì)使得液體沸騰溢出,且高溫并使蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性。因此,選取微波功率240 W。

圖1 微波功率對(duì)脫蛋白率的影響Fig.1 Effect of microwave power on deprotein rate

2.1.1.2 微波時(shí)間對(duì)脫蛋白率的影響 由圖2可知,微波時(shí)間小于5 min時(shí),蛋白質(zhì)的脫除效果隨微波時(shí)間增加而增大;微波時(shí)間大于5 min后,蛋白質(zhì)的脫除效果隨時(shí)間增加而降低;微波時(shí)間為5 min時(shí),脫蛋白率最高。原因可能是,在短時(shí)間內(nèi),微波作用在細(xì)胞膜上并使其發(fā)生較嚴(yán)重的破碎作用,使蝦頭、蝦殼內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子加劇運(yùn)動(dòng),從而擴(kuò)散出來(lái)。當(dāng)微波到一定時(shí)間后,可能存在溶解度達(dá)到飽和時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生降解現(xiàn)象[13]。故微波時(shí)間選為5 min。

圖2 微波時(shí)間對(duì)脫蛋白率的影響Fig.2 Effect of microwave time on deprotein rate

2.1.1.3 NaOH濃度對(duì)脫蛋白率的影響 由圖3可知,脫蛋白率隨NaOH濃度升高,呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì);NaOH濃度為6%時(shí),脫蛋白率最高;可能是NaOH濃度過(guò)大,使蝦頭、蝦殼中的蛋白質(zhì)水解,在堿性條件下,形成游離的氨基酸,從而減少了蛋白質(zhì)質(zhì)量,脫蛋白率降低[14]。故NaOH濃度選為6%。

圖3 NaOH濃度對(duì)脫蛋白率的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on deprotein rate

2.1.1.4 料液比對(duì)脫蛋白率的影響 由圖4可知,料液比為1∶10～1∶15時(shí),脫蛋白率隨著料液比的增大而增大,隨后小幅度下降。可能是因?yàn)?料液比變大,在制備過(guò)程中,液相濃度的增加也隨之加快。故選擇的料液比為1∶15 g/mL。

圖4 料液比對(duì)脫蛋白率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to liquid on deprotein rate

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知各因素對(duì)脫蛋白率的影響依次為:料液比(D)>微波功率(B)>NaOH濃度(A)>微波時(shí)間(C)。最優(yōu)脫蛋白工藝為A2B2C3D1,即NaOH濃度6%,微波功率240 W,微波時(shí)間7 min,料液比1∶10 g/mL,恰為正交實(shí)驗(yàn)的第5組,而第5組也正是9組實(shí)驗(yàn)中的最大組。其中,由表5可知,微波功率對(duì)蝦頭、蝦殼脫蛋白效果的影響顯著(p<0.05),料液比對(duì)脫蛋白效果的影響極顯著(p<0.01),說(shuō)明微波功率、料液比對(duì)脫蛋白率的影響較大。

表4 正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果Table 4 Results of intuitionistic analysis of orthogonal test

表5 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Result of orthogonal test analysis of variance

2.2 脫鈣工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 微波功率對(duì)脫鈣率的影響 由圖5可知,隨著微波功率升高,脫鈣率先上升后下降,微波功率240 W時(shí),脫鈣率達(dá)最大值為93.1%?？赡苁且?yàn)?在微波電磁場(chǎng)作用下,極性分子的排列快速轉(zhuǎn)向,鈣凌亂產(chǎn)生熱摩擦及碰撞,導(dǎo)致鈣分子分離出來(lái)。但微波功率過(guò)高,微波的作用下,反應(yīng)混合物中的礦物質(zhì)、無(wú)機(jī)酸分子與微波發(fā)生了強(qiáng)烈的耦合作用,使得脫鈣效果降低[15]。故微波功率選為240 W。

圖5 微波功率對(duì)脫鈣率的影響Fig.5 Effect of microwave power on decalcification rate

2.2.1.2 微波時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響 由圖6可知,脫鈣率隨微波時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在2～4 min范圍內(nèi)逐漸增加,這段時(shí)間內(nèi)蝦頭蝦殼中的鈣逐漸地與鹽酸反應(yīng),使鈣離子從分子中脫離出來(lái)。在4 min時(shí)脫鈣率達(dá)到最大,之后逐漸下降。原因可能是,在一定的微波功率下,隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng),鈣離子的穩(wěn)定性變差,其內(nèi)部受到破壞,使得鈣含量減少[16]。故選擇微波時(shí)間為4 min。

圖6 微波時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響Fig.6 Effect of microwave time on decalcification rate

2.2.1.3 HCl濃度對(duì)脫鈣率的影響 由圖7可知,脫鈣率隨著HCl濃度的增大呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì);HCl濃度為1%～3%時(shí),脫鈣率迅速升高,HCl濃度為4%時(shí),脫鈣率達(dá)到最大值,HCl濃度高于4%時(shí),脫鈣率緩慢降低?？赡苁且?yàn)?HCl濃度較大,在脫除過(guò)程中,無(wú)機(jī)鹽會(huì)發(fā)生降解反應(yīng),使脫鈣率降低[17]。故選擇HCl濃度為4%。

圖7 HCl濃度對(duì)脫鈣率的影響Fig.7 Effect of HCl concentration on decalcification rate

2.2.1.4 料液比對(duì)脫鈣率的影響 由圖8可知,料液比為1∶20～1∶35 g/mL范圍內(nèi),脫鈣率隨料液比的增加而增大;料液比1∶35 g/mL時(shí),脫鈣率達(dá)到最高;料液比高于1∶35 g/mL后,脫鈣率開(kāi)始緩慢下降?？赡苁且?yàn)?料液比太低時(shí),蝦頭、蝦殼中的鈣無(wú)法與鹽酸充分反應(yīng)從溶液中脫離出來(lái);料液比過(guò)高時(shí),會(huì)使鈣離子降解[18]。故選擇料液比為1∶35 g/mL。

圖8 料液比對(duì)脫鈣率的影響Fig.8 Effect of ratio of material to liquid on decalcification rate

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表6可知,微波技術(shù)對(duì)脫鈣率的影響依次為:HCl濃度(A)>微波功率(B)>微波時(shí)間(C)>料液比(D)。最優(yōu)脫鈣率工藝為A3B1C1D3,即HCl濃度5%,微波功率160 W,微波時(shí)間3 min,料液比1∶40 g/mL。由表7可知,HCl濃度、微波功率和微波時(shí)間對(duì)蝦頭、蝦殼中的脫鈣效果的影響具有顯著性(p<0.05),說(shuō)明這三個(gè)因素對(duì)于脫鈣率的影響較大。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of orthogonal test

表7 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Results of analysis of variance of orthogonal test

由表6可知,最佳工藝條件A3B1C1D3未在正交表中,故需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果分別為90.35%、91.79%、91.64%,平均脫鈣率為91.26%,高于表6的每一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果,因此脫鈣工藝的最佳條件是:HCl濃度5%,微波功率160 W,微波時(shí)間3 min,料液比1∶40 g/mL。

2.3 微波輔助法與傳統(tǒng)工藝的比較分析結(jié)果

采用微波輔助法與傳統(tǒng)酸堿法制備粗甲殼素,前者脫蛋白率、脫鈣率及甲殼素得率為70.85%、91.26%、26.34%,后者為42.15%、64.84%、18.43%,通過(guò)比較可知,微波輔助法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)酸堿法。因此,微波消解技術(shù)為今后研究甲殼素的制備方法提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用微波輔助法制備廣西北部灣地區(qū)南美白對(duì)蝦甲殼素并對(duì)制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)正交優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù)為:NaOH濃度6%,微波功率240 W,微波時(shí)間7 min,料液比1∶10 g/mL,脫蛋白率70.85%;HCl濃度5%,微波功率160 W,微波時(shí)間3 min,料液比1∶40 g/mL,脫鈣率為91.26%。在此條件制得的甲殼素得率為26.34%±0.24%。優(yōu)于傳統(tǒng)酸堿法甲殼素得率(18.43%±0.14%)。微波輔助法是非常具有應(yīng)用前景的制備甲殼素的新方法,為研究我國(guó)蝦頭、蝦殼等廢棄物制取甲殼素提供技術(shù)基礎(chǔ)。