鄒 勇，圖 雅，*，馮明祥，韋登雄，雷初朝

(1.關(guān)嶺布依族苗族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 關(guān)嶺 561300；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院)

蜱是寄生于人和家畜體表的一種吸血性寄生蟲，不僅能引起家畜痛癢、貧血、消瘦甚至造成動(dòng)物死亡還是多種病原體的傳播媒介如巴貝斯蟲、泰勒焦蟲等。傳統(tǒng)的寄生蟲分類鑒定?；谛螒B(tài)學(xué)特點(diǎn)，對(duì)準(zhǔn)確鑒定不同發(fā)育階段的蟲體卻具有一點(diǎn)的局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定已成為鑒定寄生蟲蟲種及研究遺傳變異最直接的方法。ITS2基因片段具有復(fù)制倍數(shù)多、選擇壓力低、進(jìn)化速度快及長度序列變異大等特點(diǎn)，因此該段序列作為遺傳分子標(biāo)記已廣泛的應(yīng)用于多種寄生蟲的分類鑒定。寄生于牛體表的蜱蟲種類較多，主要有血蜱屬、璃眼蜱屬、硬蜱屬、牛蜱屬、扇頭蜱屬、革蜱屬。

為準(zhǔn)確鑒定寄生于關(guān)嶺牛的蜱蟲種屬，為臨床用藥提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)以貴州關(guān)嶺自治縣關(guān)嶺牛體表分離的蜱蟲為試驗(yàn)對(duì)象，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增其ITS2基因，通過分析該基因的遺傳變異情況并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而對(duì)該蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體來源 實(shí)驗(yàn)所用蜱蟲采自于關(guān)嶺自治縣坡貢鎮(zhèn)某牛場，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為牛微小牛蜱，用清水洗凈蟲體表面的粘有的糞便后，置于75%的乙醇中固定，-20℃保存并做好標(biāo)記。

1.1.2 試劑 2×Taq Master Mix試劑(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)；瓊脂糖(Amresco)； DNA Marker DL2000(TaKaRa)；6×Loading buffer(TaKaRa)；溴化乙錠(TaKaRa)；無水乙醇(天津福晨化學(xué)試劑廠)；ddH2O。

1.2 方法

1.2.1 蟲體DNA 提取 將單個(gè)蟲體從75%的乙醇保存溶液中取出，置于無菌的平皿中，挑破蜱蟲腹腔，用滅菌蒸餾水反復(fù)沖洗2～3次，剪取一小段約1 cm的蟲體組織置于高壓滅菌處理過的1.5 mL的離心管中，用滅菌的眼科剪將蟲體剪碎，加入200 μL GA Buffer，用塑料研磨棒反復(fù)研磨至勻漿狀，再加入20 μL蛋白酶K，充分混勻，水浴56℃過夜消化，將消化完全的組織液按基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序 采用引物TITS2F1：5'-CGAGACTTGGTGTGAATTGCA-3'；TITS2R1：5'-TCCCATACACCACATTTCCCG-3'擴(kuò)增牛蜱蟲的ITS2基因，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃ 5 min，變性94℃ 45s，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，再延伸72℃ 10 min，4℃保存，同時(shí)設(shè)立未加DNA模板的等體積陰性對(duì)照。取3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混合均勻后，小心加樣于10 g/L TBE瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，以相同體積的DNA Marker DL2000作對(duì)照進(jìn)行電泳，設(shè)定電泳條件為100V、電泳時(shí)間30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 序列分析及種系進(jìn)化樹的構(gòu)建 將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)。用Clustal 1.83軟件對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用DNAstar 5.0 軟件中的Megalign程序進(jìn)行同源性比對(duì)。從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索現(xiàn)有硬蜱科ITS2基因序列，以軟蜱科波斯銳緣蜱為外群(Argas persicus，登錄號(hào)：KJ133607)，以微小牛蜱(Boophilus microplus，登錄號(hào)：BMU97713)、外翻扇頭蜱(Rhipicephalus evertsi，登錄號(hào)：DQ849265)、環(huán)形牛蜱(Boophilus annulatus，登錄號(hào)：JQ412126)、消色牛蜱(Boophilus decoloratus，登錄號(hào)：BDU97716)、囊形扇頭蜱(Rhipicephalus bursa，登錄號(hào)：KM986320)、血紅扇頭蜱(Rhipicephalus sanguineus，登錄號(hào)：JQ412127)、附尾扇頭蜱(Rhipicephalus appendiculatus，登錄號(hào)：RAU97704)為參考蟲株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用MEGA5.0程序中的鄰接法(NJ)，選用Kimura2-parameter模式繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自展檢驗(yàn)(Bootstrap test)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性，復(fù)制數(shù)均為1 000。

1.2.4 驅(qū)蟲試驗(yàn) 對(duì)牛場牛群使用蟲退(伊維菌素注射液)，按每頭0.02 ml/kg劑量注射病牛(懷孕母牛人工清除)，連續(xù)使用35 d后，觀察牛群體型及精神狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 蜱蟲ITS2基因擴(kuò)增

對(duì)采自關(guān)嶺自治縣花江鎮(zhèn)關(guān)嶺牛的蜱蟲樣品的ITS2基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長約1 000 bp的片段，與預(yù)期目的片段長度相符，且無非特異性條帶(圖1)。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. ITS2基因；2. 陰性對(duì)照

2.2 ITS2基因序列比對(duì)及遺傳變異分析

將關(guān)嶺牛蜱蟲(GLT)的ITS2序列兩端的模糊序列去除后，與GenBank數(shù)據(jù)庫中硬蜱科的參考蟲株序列相比對(duì)，其與參考蟲株牛微小牛蜱(登錄號(hào)：BMU97713)的同源性為99.4%，與其他參考蟲株的同源性在38.6～89.7之間(圖2)。

圖2 關(guān)嶺牛蜱蟲分離株與參考蜱蟲的ITS2基因同源性分析

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析

為了研究關(guān)嶺牛蜱蟲的遺傳進(jìn)化地位，基于ITS2基因采用Mega 5.0軟件中的最大似然法(Maximum Likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。關(guān)嶺牛蜱蟲與GenBank數(shù)據(jù)庫中的微小牛蜱(B. microplus，登錄號(hào)：BMU97713)聚于同一支，自展檢驗(yàn)值為100。

注：節(jié)點(diǎn)處數(shù)據(jù)為ML的Bootstrap值(%)

2.4 驅(qū)蟲試驗(yàn)分析

經(jīng)過連續(xù)35d不間斷對(duì)感染牛只注射蟲退(伊維菌素注射液)，112頭牛體表不再寄生有蜱蟲，且牛只采食量增加、體重增加，精神得到恢復(fù)。

3 討論

生物普遍存在遺傳變異，基于分子生物學(xué)的鑒別方法已成功用于多種寄生蟲的分類鑒定。寄生于牛體表的蜱蟲種類較多，分子鑒定彌補(bǔ)了形態(tài)鑒定的不足，不受生活史，發(fā)育階段的限制。本試驗(yàn)以關(guān)嶺牛蜱蟲分離株為研究對(duì)象，以ITS2基因?yàn)檫z傳分子標(biāo)記對(duì)分離的關(guān)嶺牛蜱蟲進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的微小牛蜱(B. microplus，登錄號(hào)：BMU97713)的同源性為99.4%，而與其他參考蟲株的同源性為38.6～89.7?；贗TS2基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)嶺牛蜱蟲與GenBank數(shù)據(jù)庫中的微小牛蜱(B. microplus，登錄號(hào)：BMU97713)聚于同一支，與其他參考蟲株位于不同分支。因此，所研究的關(guān)嶺牛蜱蟲為牛微小牛蜱，ITS2基因能夠作為牛蜱鑒定的分子診斷標(biāo)記。經(jīng)過蟲退(伊維菌素注射液)治療35 d后，112頭感染牛只全部康復(fù)，治愈率達(dá)100%，說明該藥物具有較好的治療效果，關(guān)嶺自治縣的微小牛蜱對(duì)該藥物敏感，可用于關(guān)嶺自治縣牛蜱蟲病的治療與預(yù)防。