楊曉蘭 佟 巖 雷小林 徐林初 高立志

(1. 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)，植物種質(zhì)與基因組學(xué)中心，云南 昆明 650201；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032)

基因組大小或稱C值，是指一個(gè)物種的配子體細(xì)胞核中染色體未進(jìn)行復(fù)制時(shí)的DNA含量[1-2]，與物種的分類、進(jìn)化及遺傳等密切相關(guān)，是研究生物基因組多樣性非常重要的特征參數(shù)[3]。迄今為止，測(cè)定基因組大小的方法主要有3種：孚耳根微顯影、基因組測(cè)序法以及流式細(xì)胞術(shù) (FCM)[4-5]。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方便、分析快速、能在短時(shí)間內(nèi)計(jì)算估測(cè)植物基因組C值，是測(cè)定C值的首選方法[6]。早在1983年Galbraith應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)17種植物的DNA-C值進(jìn)行檢測(cè)，開創(chuàng)了流式細(xì)胞術(shù)在植物中運(yùn)用的先河[7]。目前應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定C值的方法在許多植物中均已有相關(guān)報(bào)道[8-12]。

油茶 (Camilliaoleifera) 隸屬于山茶屬之油茶組 (Sect.Oleifera)，種子含油量較高，與油棕 (Elaeisguineensis)、油橄欖 (Oleaeuropaea) 與椰子 (Cocusnucifera) 并稱為世界四大木本油料作物[13]。由油茶籽壓榨而獲得的茶油是一種優(yōu)質(zhì)食用油，因其化學(xué)成分與橄欖油相似，故有 “東方橄欖油” 之美譽(yù)[14]。茶油中富含油酸、亞油酸及亞麻酸等多種不飽和脂肪酸[15]，對(duì)降低心血管疾病、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇水平、預(yù)防與治療高血壓及預(yù)防某些癌癥疾病有顯著作用[16]，其余產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥中也有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[17-20]。迄今，我國(guó)油茶栽培面積已達(dá)370萬(wàn)hm2，目前中國(guó)正面臨著食用油自給不足的境況，因此提高油茶產(chǎn)量迫在眉睫[21]。2013年，Huang等報(bào)道了應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定約90余種山茶屬植物的基因組大小[22]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)油茶品種C值的研究報(bào)道甚少，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)15個(gè)油茶品種進(jìn)行2C值的檢測(cè)分析及基因組大小估測(cè)，為油茶的基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及種質(zhì)資源的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

15份油茶材料均于2018年3月中旬采自江西省林業(yè)科學(xué)院，剪取含嫩葉及嫩芽的枝條置于裝有少量水的水桶中帶回實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)換水，備用。以基因組大小為389 Mb的水稻日本晴 (Oryzasativasubsp.japonicacv. Nipponbare) 為標(biāo)樣，種子由菲律賓國(guó)際水稻研究所提供，將種子置于濕潤(rùn)培養(yǎng)皿中于20 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d萌發(fā)后種植于溫室備用。實(shí)驗(yàn)材料取自油茶與水稻日本晴植物剛抽出的嫩葉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1解離液篩選與熒光染料配制

流式細(xì)胞術(shù)有多種解離液及配制方法，為篩選出適用于油茶C值測(cè)定的最佳方法，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Galbraith′s (Gal)、WPB、Tris-MgCl2、Otto等4種常用解離液配方進(jìn)行篩選[7,23-25]，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Otto與WPB對(duì)水稻日本晴能檢測(cè)出穩(wěn)定峰形，而Gal與Tris-MgCl2對(duì)水稻日本晴細(xì)胞核解離效果較差，出峰不穩(wěn)定，峰形較差；由于油茶中含有大量糖類、酚類等活性物質(zhì)[26]，常規(guī)Gal、WPB、Tris-MgCl2、Otto等解離液對(duì)其解離效果較差，出峰效果差且雜質(zhì)峰較多，而改良的Otto法對(duì)油茶的適用性較好，峰形穩(wěn)定，因此選改良Otto解離液為本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞解離液。熒光染料為終濃度1 mg/mL的碘化丙啶 (Propidium iodide, PI) 溶液，避光保存。Otto解離液配方為 (改良)[25]：OttoI—100 mmol/L 檸檬酸，0.5% (體積比) Tween 20, pH 2.0～3.0，4 ℃冰箱保存 (加少量PVP)；Otto II—400 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 2.0～3.0，常溫下保存 (在使用時(shí)加少量PVP)。

1.2.2細(xì)胞核懸液制備與DNA特異性染色

取少量 (約40～50 mg) 日本晴標(biāo)樣與油茶待測(cè)樣品嫩葉于培養(yǎng)皿中，將其置于冰上冰?。患尤? mL冰浴的細(xì)胞解離液OttoI；快速切碎；混勻，用300目尼龍網(wǎng)過濾；13 000 r/min離心30 s，棄上清，加100 μL OttoI搖勻，室溫培養(yǎng)0.5～1 h；加1 mL Otto II，搖勻；加10 μL 10 mg/mL的核糖核酸酶A溶液 (RNase A Solution)，80 μL PI熒光染料，避光保存以備上機(jī)。

1.2.3上機(jī)檢測(cè)與數(shù)據(jù)收集

將制備好的細(xì)胞核懸液用300目尼龍網(wǎng)過濾至5 mL聚苯乙烯無(wú)帽圓底未滅菌流式管，用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，設(shè)置參數(shù)，PI激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，上機(jī)后收集通道FL2的熒光、檢測(cè)PI發(fā)射的熒光強(qiáng)度，每次收集2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，每種植物取3次重復(fù)。收集數(shù)據(jù)以備分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用BD FACSCalibur自帶軟件Cellquest進(jìn)行分析。變異系數(shù) (CV) 控制在6%以內(nèi)。內(nèi)標(biāo)日本晴的基因組大小為389 Mbp，根據(jù)公式 (1)：待測(cè)樣本的基因組大小=標(biāo)樣基因組大小 ×(待測(cè)樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度/標(biāo)樣G0/G1峰熒光強(qiáng)度) 計(jì)算15個(gè)待測(cè)樣本的基因組大小值，2C值參照1 pg=978 Mbp計(jì)算得到[27-29]。收集數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)采用水稻日本晴作為內(nèi)標(biāo)，分別測(cè)定了15個(gè)油茶材料的細(xì)胞懸浮液，部分測(cè)試結(jié)果如圖1。

括號(hào)中的數(shù)字為熒光強(qiáng)度平均值；M1為標(biāo)出的熒光強(qiáng)度范圍。

圖1水稻日本晴與部分樣品樣品流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果
Fig.1 Results ofO.sativaandC.oleiferausing FMC

內(nèi)標(biāo)水稻日本晴的DNA含量1C=0.397 5 pg，即其基因組大小為389 Mbp[30]。根據(jù)公式 (1) 計(jì)算本研究15份待測(cè)樣品的基因組大小，結(jié)果見表1。

山茶屬植物約有280余種[31]，目前僅有90余種的C值已被前人測(cè)定[22]。油茶作為山茶屬油茶組中種子含油量較高的一個(gè)種，在我國(guó)的栽培面積最大且栽培歷史最為悠久，對(duì)其進(jìn)行基因組大小測(cè)定對(duì)進(jìn)一步開展基因組學(xué)研究具有重要意義。從表1可知：15個(gè)油茶品種的2C值范圍在13.11～19.22 pg之間，其中2C值最小的是贛興系列的贛興47 (13.11 pg)，最大的是贛無(wú)系列的贛無(wú)12 (19.22 pg)，與此前報(bào)道的同屬植物2C值波動(dòng)范圍相近，除贛興47、贛55、贛60及贛190四個(gè)品種外，其余品種的2C值均大于15.00 pg。多數(shù)品種的2C值介于15.00～18.00 pg之間，15個(gè)品種中只有贛無(wú)12的DNA-2C值大于18.00 pg。15個(gè)品種的基因組大小范圍為6 411.99～9 398.58 Mbp，其中基因組大小大于7 000 Mbp的品種占總體86%。根據(jù)單因素方差結(jié)果顯示15個(gè)油茶品種整體P=0.007 < 0.05，表明樣本之間存在顯著性差異。

表1 15個(gè)油茶品種的基因組大小Table 1 The genome size of 15 cultivars of C.oleifera

3 結(jié)論與討論

油茶作為我國(guó)栽培歷史悠久及栽培面積較大的重要油料樹種，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值早已得到廣泛關(guān)注，油茶研究工作者一直致力于油茶良種的選育，旨在增加油茶產(chǎn)量，提高茶油得率。植物DNA-C值數(shù)據(jù)庫(kù)于2012年已更新至6.0版本，目前該數(shù)據(jù)庫(kù)記錄了8 510種植物的DNA-C值數(shù)據(jù)，包括7 542種被子植物，355種裸子植物，128種蕨類植物，232種苔蘚植物及253種藻類植物[32]，該數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于油茶DNA-C值記錄較少。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于油茶品種C值的研究報(bào)道甚少。本研究所選擇的15個(gè)油茶品種中贛石84-8、贛永6、贛190、贛興46、贛無(wú)11、贛無(wú)12及贛無(wú)24七個(gè)品種為江西省國(guó)審良種，這些品種適宜栽培面積較廣且干仁含油率均大于45%，具有抗性強(qiáng)、結(jié)實(shí)早、產(chǎn)量高與豐產(chǎn)性能好等特征[33]。本研究采用基因組大小已知的水稻日本晴作為內(nèi)標(biāo)，水稻日本晴與待測(cè)油茶樣品的DNA含量CV值在線性標(biāo)尺模式下均控制在6%以內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

在應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)估測(cè)植物基因組大小的過程中，材料組織、解離液及染色試劑的選擇尤為重要[6]。關(guān)于解離液的適用性，經(jīng)過4種解離液的反復(fù)篩選，最終發(fā)現(xiàn)改良的Otto法對(duì)油茶品種的細(xì)胞解離效果更佳，能檢測(cè)出較穩(wěn)定的峰形。關(guān)于供試材料的選擇，經(jīng)嫩葉與成熟葉片對(duì)比發(fā)現(xiàn)嫩葉組織解離效果更佳，因此采用水稻種子萌發(fā)種植于溫室7 d后的嫩葉，油茶均采用剛抽出的頭3片嫩葉，每個(gè)樣本剪取質(zhì)量不超過50 mg。標(biāo)樣與待測(cè)樣品的懸浮液在加入PI熒光染料避光染色10 min后再進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

本研究采用的內(nèi)標(biāo)水稻日本晴的基因組大小為389 Mbp，根據(jù)公式計(jì)算得到贛55、贛60、贛71、贛190、贛833、贛無(wú)11、贛無(wú)12、贛無(wú)23、贛無(wú)24、贛石83-2、贛石83-3、贛石84-8、贛永6、贛興46與贛興47的基因組大小分別為7 268.70、6 970.13、7 446.85/7 085.32、8 458.23、7 705.29、9 398.58、8 193.28、7 435.63、8 596.78、8 296.73、7 920.70、8 009.80、8 682.67和6 411.99 Mbp，與前人報(bào)道的同屬90余種植物的基因組大小范圍相近[26]。方差分析結(jié)果表明，15個(gè)油茶品種的基因組大小存在顯著性差異。油茶作為我國(guó)南方的重要木本油料樹種，迄今為止國(guó)內(nèi)關(guān)于油茶的C值報(bào)道甚少，在本研究中改良的油茶細(xì)胞核懸液制備為今后測(cè)定山茶屬其它植物的C值提供了一定參考。

本研究以水稻日本晴為內(nèi)標(biāo)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了15個(gè)油茶品種的基因組大小，這些數(shù)據(jù)不僅可以豐富山茶屬植物的C值庫(kù)，而且將為油茶的基因組測(cè)序、品種改良、種質(zhì)資源研究及細(xì)胞生物學(xué)研究提供參考依據(jù)。