鄭艷玲 馬煥成

(西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

現(xiàn)代蘇鐵類植物包括蘇鐵科 (Cycadaceae)、托葉鐵科 (Stangeriaceae) 和澤米鐵科 (Zamiaceae) 11屬約290種，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，除少數(shù)種類外，通常不能忍受冰凍和嚴(yán)寒。我國(guó)僅有蘇鐵屬 (Cycas) 1屬，且是該屬植物的多樣性分布中心，但由于人為采挖和棲息地破壞等因素，現(xiàn)存種群正面臨滅絕的威脅。我國(guó)蘇鐵屬所有種類均已列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，云南分布的蘇鐵屬植物占全國(guó)的一半左右[1]。其中具三回羽狀二叉分歧復(fù)葉的多歧蘇鐵 (Cycasmultipinnata) 屬于叉葉類蘇鐵，在云南省分布于紅河州的屏邊、河口和個(gè)舊等地，是熱帶石山季雨林或山地雨林下的熱帶森林植物區(qū)系成員[2]。研究表明，植物的分布區(qū)未必是其生長(zhǎng)最適宜的地區(qū)而是其競(jìng)爭(zhēng)力最強(qiáng)的地區(qū)，同樣植物的分布區(qū)域狹窄，可能僅僅是因?yàn)榈乩碚系K限制了其遷移[3]。多歧蘇鐵的分布區(qū)域較為狹窄，其生態(tài)適應(yīng)性如何及其是否與該物種的局限分布及瀕危狀況有關(guān)尚不清楚。

干旱是全球氣候變化的主要結(jié)果和主要表現(xiàn)之一，近半個(gè)世紀(jì)以來全球范圍內(nèi)干旱發(fā)生的頻率和強(qiáng)度都在急劇增加[4]。近年來，在全球氣候變化的大背景下，我國(guó)的氣候與環(huán)境也發(fā)生了顯著變化，氣候變暖導(dǎo)致區(qū)域性干旱事件連年發(fā)生。近50年西南地區(qū)總體呈氣溫升高，降水減少，干旱化加重的趨勢(shì)。對(duì)于干旱的多數(shù)研究特別是室內(nèi)研究?jī)H考慮干旱對(duì)植物的影響，然而干旱可能會(huì)發(fā)生在任何季節(jié)，因此，溫度與干旱緊密聯(lián)系，但是它們的復(fù)合脅迫是如何影響植物的卻研究甚少。本研究以多歧蘇鐵離體葉片為材料，研究高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵生理指標(biāo)的影響，這對(duì)了解多歧蘇鐵的瀕危機(jī)制及氣候變化背景下多歧蘇鐵的生態(tài)適應(yīng)性提供理論依據(jù)，進(jìn)而為多歧蘇鐵的引種馴化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及其處理

在云南省河口縣 (東經(jīng)103°24′，北緯22°36′) 從多年生多歧蘇鐵植株上剪下葉柄頂端部分，插在水中，當(dāng)天帶回昆明。第2天進(jìn)行高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理。共有4個(gè)處理，以在30 ℃水中處理2 h的葉片作為對(duì)照 (CK)。高溫處理時(shí)，將葉柄插在盛水的廣口瓶中，在50 ℃培養(yǎng)箱中暗處理2 h；干旱處理時(shí)，將葉柄插在0.40 g/mL的聚乙二醇 (PEG) 中于30 ℃處理24 h。干旱復(fù)合脅迫時(shí)，將在0.40 g/mL的PEG中于30 ℃處理24 h的葉片再在50 ℃培養(yǎng)箱中處理2 h。每處理設(shè)4次重復(fù)，每次重復(fù)1個(gè)葉片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色素含量測(cè)定

采用95%乙醇浸提法[5]測(cè)色素含量，4次重復(fù)測(cè)定。

1.2.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

測(cè)量前，葉片暗適應(yīng)30 min。采用 PAM-2500調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x (WALZ, Germany) 測(cè)定 ，光系統(tǒng)II (PSII) 最大光化學(xué)效率 (Fv/Fm)、PSII實(shí)際光化學(xué)效率 (YII)、光化學(xué)淬滅系數(shù) (qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù) (NPQ)、PS II處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量 (YNPQ)、PS II處非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量 (YNO) 和電子傳遞速率 (ETR) 均由儀器讀取，4 次重復(fù)測(cè)定。

1.2.3丙二醛含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法[5]測(cè)定丙二醛 (MDA) 含量，4次重復(fù)測(cè)定。

1.2.4抗氧化酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶 (SOD) 活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法；過氧化物酶 (POD) 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶 (CAT) 活性測(cè)定，以1分鐘內(nèi)240 nm下吸光度降低0.10為1個(gè)酶活性單位[5]，4次重復(fù)測(cè)定。

1.2.5可溶性糖和脯氨酸含量測(cè)定

可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法，脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮法[5]，4次重復(fù)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各指標(biāo)采用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Excel 2007制圖表，所有數(shù)據(jù)采用均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片色素含量的影響

由表1可知，與CK相比，高溫及干熱復(fù)合脅迫處理后多歧蘇鐵的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素 (a + b) 的含量均升高，干旱處理后以上指標(biāo)均下降，但均與CK無顯著差異。高溫、干旱及干熱復(fù)合脅迫處理后，葉綠素a/b均比CK升高，但與CK無顯著差異。高溫處理后，類胡蘿卜素含量升高；但干旱和干熱復(fù)合脅迫處理后其含量降低，但均與CK無顯著差異。

2.2 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表2可知，高溫、干旱及干熱復(fù)合脅迫處理后，F(xiàn)v/Fm、Y(II) 和ETR均比CK顯著下降 (P< 0.05)，且高溫及干熱復(fù)合脅迫處理間Fv/Fm、Y(II) 和ETR無顯著差異，但都顯著低于干旱處理 (P< 0.05)。高溫處理后的YNPQ比CK顯著升高 (P< 0.05)，但干旱和干熱復(fù)合脅迫處理后的YNPQ與CK無顯著差異；干旱處理后的YNO與CK無顯著變化，但高溫及干熱復(fù)合脅迫處理后顯著升高 (P< 0.05)，且干熱復(fù)合脅迫處理后YNO顯著高于高溫處理 (P< 0.05)。高溫及干熱復(fù)合脅迫處理后qP顯著低于CK (P< 0.05)，但干旱處理后qP與CK無顯著變化；高溫及干熱復(fù)合脅迫處理后的NPQ與CK無顯著差異，但干旱處理后比CK顯著提高 (P< 0.05)。

表1 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片色素含量的影響Table 1 Effects of heat, drought and their combined stress on pigment content of C.multipinnata leaves

注：不同小寫字母表示差異顯著。

注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.3 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片丙二醛含量的影響

由圖1可知，高溫及干熱復(fù)合脅迫處理后，MDA含量均比CK顯著降低 (P< 0.05)，但干旱處理后MDA含量無顯著變化。

2.4 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片抗氧化酶活性的影響

由表3可知，高溫處理后，SOD活性與CK無顯著差異，但干旱及干熱復(fù)合脅迫處理后SOD活性均比CK顯著升高 (P< 0.05)。高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理后，POD活性均比CK顯著升高 (P<0.05)，且干旱處理后POD活性最高。高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理后，CAT活性均與CK無顯著差異，但干熱復(fù)合脅迫處理后的CAT顯著高于高溫及干旱處理 (P< 0.05)。

表3 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片SOD、POD和CAT活性的影響Table 3 Effects of heat, drought and their combined stress on SOD, POD and CAT activities of C.multipinnata leaves

注：不同小寫字母表示差異顯著。

不同小寫字母表示差異顯著。

圖1高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片MDA含量的影響
Fig.1 Effects of heat, drought and their combined stress on MDA content ofC.multipinnataleaves

2.5 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響

由圖2可知，高溫處理后可溶性糖含量比CK升高9.51%，干旱及干熱復(fù)合脅迫處理后，可溶性糖含量分別比CK降低4.75%和21.42%，但高溫、干旱及干熱復(fù)合脅迫處理后，可溶性糖含量與CK無顯著差異。

不同小寫字母表示差異顯著。

圖2高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片可溶性糖含量的影響
Fig.2 Effects of heat, drought and their combined stress on soluble sugar content ofC.multipinnataleaves

由圖3可知，高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理后，可溶性糖含量分別比CK下降44.56%、61.07%和24.27%，脯氨酸含量均比CK顯著下降 (P< 0.05)，但干熱復(fù)合脅迫處理后，脯氨酸含量與CK無顯著差異。

不同小寫字母表示差異顯著。

圖3高溫、干旱及其復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵葉片脯氨酸含量的影響
Fig.3 Effects of heat, drought and their combined stress on proline content ofC.multipinnataleaves

3 結(jié)論與討論

在復(fù)合脅迫下，被單一脅迫激活的信號(hào)通路可能被共同激活，同時(shí)復(fù)合脅迫特有的一些同路也可能被激活[6]，因此植物可能需要獨(dú)特的分子和代謝調(diào)控來適應(yīng)不同脅迫的復(fù)合脅迫。在全球氣候變化下，高溫和干旱事件頻發(fā)，且高溫和干旱經(jīng)常伴隨發(fā)生，但高溫干旱復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵有何影響尚不清楚。30 ℃條件下，插在水中3天的多歧蘇鐵離體葉片形態(tài)上無顯著變化，且其葉綠素?zé)晒鈪?shù)也無顯著變化。在0.20 mg/g PEG中處理24 h的多歧蘇鐵離體葉片的Fv/Fm與CK并無顯著差異[7]，因此本研究將PEG濃度提高到0.40 mg/g。45 ℃及其以下溫度熱激不會(huì)影響多歧蘇鐵的光合活性[8]，故本研究將溫度設(shè)置為50 ℃。

葉綠素在光的吸收，能量傳遞和電子傳遞中起重要作用。在不同的脅迫條件下，植物的色素含量會(huì)降低或不發(fā)生變化[9-11]，還有一些植物的色素含量會(huì)升高[12-13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，多歧蘇鐵的葉綠素含量隨溫度升高呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢(shì)[8]。因此，高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理后，多歧蘇鐵的色素組成和含量雖無顯著變化，但并不表明這些脅迫對(duì)多歧蘇鐵的色素合成和降解沒有影響。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以指示植物的光合特性和脅迫耐性[14]。Fv/Fm,YII，ETR和qP分別反映PSII的潛在效率，線性電子傳遞的相對(duì)活性，通過PSII電子傳遞的相對(duì)速率和PSII反應(yīng)中心的開放程度[15-16]。YNO是光損傷重要指標(biāo)，數(shù)值升高表明植物不能有效控制所吸收的光能量[17-18]。高溫和干熱復(fù)合脅迫處理后，F(xiàn)v/Fm、YII、ETR和qP的降低以及YNO的升高，表明多歧蘇鐵的光合活性在高溫和干熱復(fù)合脅迫下均下降。干熱復(fù)合脅迫處理后YNO顯著高于高溫處理 (P< 0.05)，表明干熱復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵的影響更大。干旱處理后Fv/Fm，YII和ETR比CK顯著降低 (P< 0.05)，但都顯著高于高溫和干熱復(fù)合脅迫處理 (P< 0.05)，表明多歧蘇鐵受到干旱脅迫的影響而導(dǎo)致光合活性下降，但干旱較高溫及干熱復(fù)合脅迫對(duì)多歧蘇鐵的影響要小。這與干旱處理后qP和YNO與CK無顯著差異相一致。

生物膜會(huì)感知各種環(huán)境因子的脅迫而做出響應(yīng)[19]，MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，可以反映膜受損程度。對(duì)多歧蘇鐵而言，高溫和干熱復(fù)合脅迫對(duì)其光合活性影響較大，而干旱脅迫對(duì)其影響較小，但干旱處理后MDA含量無顯著變化，高溫和干熱復(fù)合脅迫處理后MDA含量卻顯著降低 (P< 0.05)。對(duì)其它植物的一些研究也表明，MDA含量并不能指示一些脅迫的嚴(yán)重程度[20-21]。這種現(xiàn)象的機(jī)理尚不清楚，但它可能跟涉及膜脂過氧化過程的一些酶活性的變化有關(guān)。大量研究表明，抗氧化酶通過清除活性氧而在植物的抗脅迫過程中發(fā)揮重要作用[22]，然而不同的酶在不同的脅迫條件下可能呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式，因此在植物抗脅迫過程中具體發(fā)揮作用的酶種類取決于物種和脅迫類型等因素[23-24]。在多歧蘇鐵受到高溫、干旱及其復(fù)合脅迫時(shí)，SOD，POD和CAT活性也表現(xiàn)出不同的變化模式，高溫下POD活性的升高以及干旱和干熱復(fù)合脅迫下SOD和POD活性的升高，表明它們分別在多歧蘇鐵抗高溫以及干旱和干熱復(fù)合脅迫中起著重要作用。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)除了滲透調(diào)節(jié)功能外，還可作為滲透保護(hù)劑保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[25]。 高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理后，可溶性糖含量并無顯著變化，且高溫和干旱脅迫處理后脯氨酸含量顯著降低 (P< 0.05)。由此表明，可溶性糖和脯氨酸并未參與到多歧蘇鐵對(duì)以上脅迫類型的適應(yīng)過程中；其他研究也表明，特定滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與植物抗脅迫的相關(guān)性及其在植物抗脅迫中的相對(duì)貢獻(xiàn)因植物種類，品種和脅迫強(qiáng)度而異[25-28]。

綜上所述，多歧蘇鐵受到高溫、干旱及其復(fù)合脅迫處理后，光合活性下降。研究表明，多種脅迫的復(fù)合脅迫效應(yīng)可能是相互拮抗或增效的[29]。根據(jù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)判斷，多歧蘇鐵受干旱影響最小，受干熱復(fù)合脅迫影響最大，可見干旱不會(huì)減輕反而會(huì)加劇高溫對(duì)多歧蘇鐵的生理影響，POD在抗高溫脅迫中以及POD和SOD在抗干旱和高溫復(fù)合脅迫中可能起了重要作用。在自然生境中，多歧蘇鐵的群落具多樣性，反映其生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)[2]。前期研究也顯示多歧蘇鐵對(duì)高溫和干旱都具一定的耐受性[7-8]，但是極端干旱和高溫會(huì)降低多歧蘇鐵的代謝活性，尤其是當(dāng)2種極端氣候同時(shí)發(fā)生時(shí)這種影響效果會(huì)加劇。因此，生境破壞導(dǎo)致的生態(tài)因子的變化包括高溫和干旱尤其是其復(fù)合脅迫是多歧蘇鐵瀕危因素之一，在遷地保護(hù)時(shí)，也應(yīng)考慮極端干旱和高溫對(duì)該物種的影響。