王 蕾，董青青，苗 峙，徐曼麗，張同存，羅學(xué)剛

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實驗室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

乳腺癌是世界高發(fā)癌癥之一，是威脅女性生存的首要因素．目前，乳腺癌在我國呈現(xiàn)出了發(fā)病年齡年輕化、惡性程度不斷升高、發(fā)病率增加而預(yù)后差等特點(diǎn)[1]．與其他惡性腫瘤一樣，乳腺癌細(xì)胞往往因為增殖迅速而導(dǎo)致附近組織血管氧供血不足，并可在缺氧條件下生存，誘導(dǎo)惡性選擇及遷移的發(fā)生．因此，探究乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的缺氧應(yīng)答機(jī)制對于相關(guān)疾病的臨床合理用藥及新藥研發(fā)具有十分重要的理論指導(dǎo)意義．

SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是2004年由日本科學(xué)家 Hamamoto等[2]發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶，可特異性甲基化組蛋白 H3K4、H4K5、H4K20[3-5]，并作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子上的“CCCTCC”或“GGAGGG”結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程．研究[2，6-7]已發(fā)現(xiàn)，SMYD3在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤中均存在高表達(dá)，并參與細(xì)胞增殖、黏附與遷移[8-11]．然而，迄今為止，SMYD3與腫瘤細(xì)胞缺氧應(yīng)答的關(guān)系在國內(nèi)外均未見報道．鑒于此，本文對氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)缺氧損傷情況下，檢測 T47D乳腺癌細(xì)胞的存活、細(xì)胞周期以及SMYD3轉(zhuǎn)錄水平的變化，并就SMYD3過表達(dá)對氯化鈷作用的影響情況進(jìn)行了分析與探討．

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

人乳腺癌細(xì)胞系 T47D購自上海哈靈生物有限公司，并在本實驗室長期保存．胎牛血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國 Gibco公司；CoCl2，美國 Sigma公司；Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國 Invitrogen公司；SYBR GREEN染料，德國 DBI公司；青霉素、鏈霉素、胰酶、MTT、PI及RNase A，北京索萊寶科技有限公司．pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3質(zhì)粒由美國 OSI制藥公司Kenneth W．Foreman博士饋贈[12]．

ABI-Step OneTM型實時熒光定量 PCR儀，美國ABI公司；BD Accuri C6流式細(xì)胞儀，美國 BD公司．

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系 T47D使用含 10%,胎牛血清、100,U/mL青霉素、0.1,mg/mL鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基，在飽和水蒸氣、5%,CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行37,℃貼壁培養(yǎng)．待細(xì)胞匯合度達(dá)到 70%～90%,時，采用0.25%,胰酶溫和消化傳代．

1.3 MTT法

將細(xì)胞以每孔 5×103個細(xì)胞的細(xì)胞密度種入96孔板中，12,h后換成無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行24,h細(xì)胞歸一化處理．第 2天，加入 CoCl2溶液(終濃度為 0、50、100、200、400,μmol/L)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24,h．隨后，每孔加入10,μL 5,mg/mL MTT溶液，避光 37,℃反應(yīng) 4,h后隨即棄去培養(yǎng)基，加入 150,μL DMSO溶解形成的甲瓚結(jié)晶．在酶標(biāo)儀中檢測570,nm 波長下的吸光度，按照式(1)計算相對細(xì)胞活力．

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

收集處理組和對照組細(xì)胞，用 4,℃預(yù)冷的 PBS洗滌2次后，將細(xì)胞滴加至PBS稀釋的75%,乙醇中固定，-20,℃靜置過夜．第 2天，將固定好的細(xì)胞離心收集，并用 PBS清洗 2次后，加入 500,μL含50,μg/mL PI和 0.1%, RNase A 的 PBS 并吹勻，4,℃避光染色 30,min后即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)由ModFIT軟件進(jìn)行分析．

1.5 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

將細(xì)胞以 5×104,mL-1種入 6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后梯度加入 CoCl2至終濃度為 0、50、100、200、400,μmol/L，放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24,h．第 2天，將處理過的細(xì)胞加入 1,mL Trizol，4,℃下裂解提取RNA．取2,μg總RNA加入M-MLV及隨機(jī)引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨后即可進(jìn)行PCR．PCR所用到的引物序列為：GAPDH，上游 5'-ATTCAACG GCACAGTCAAGG-3'，下游 5'-GCAGAAGGGGCG GAGATGA-3'；SMYD3，上游 5'-CCCAGTATCTCT TTGCTCAATCAC-3'，下游 5'-ACTTCCAGTGTGCC TTCAGTTC-3'．PCR 反應(yīng)條件為：95,℃預(yù)變性10,min；95,℃ 15,s，60,℃ 1,min，共 40 個循環(huán)，并以ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行計算．

1.6 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計

本文所有實驗結(jié)果均至少重復(fù)3次，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)由 Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，*和**分別表示與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)和極顯著差異(P＜0.01)．

2 結(jié)果與分析

2.1 CoCl2抑制T47D細(xì)胞的活力

在加入 CoCl2處理 24,h后，MTT法檢測 CoCl2對 T47D細(xì)胞的增殖影響情況發(fā)現(xiàn)：隨著濃度的增加，T47D細(xì)胞增殖受到明顯抑制，呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性(圖 1)．在 400,μmol/L CoCl2處理后，細(xì)胞存活率降到了(58.36±8.31)%，活細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組細(xì)胞(P＜0.01)，表明 CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)缺氧會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，抑制細(xì)胞活力．

圖1 CoCl2對T47D細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effect of CoCl2 on proliferation of T47D cells

2.2 CoCl2誘導(dǎo)T47D細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期周期阻滯

為進(jìn)一步探究 CoCl2對 T47D細(xì)胞活力的抑制作用機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)對加藥后的細(xì)胞周期分布進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖2所示．在0、100、400,μmol/L CoCl2培養(yǎng)24,h后，T47D細(xì)胞的G0/G1期含量發(fā)生了不同程度的變化．隨著 CoCl2給藥濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞峰型面積呈顯著的上升趨勢，與對照組細(xì)胞相比，加入 400,μmol/L CoCl2處理 24,h后，G0/G1期細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)(圖 3)，在總體細(xì)胞中所占比例由(50.32±1.12)%增至(75.69±3.58)%，而 S期細(xì)胞所占比例則由(26.48±0.75)%,降至(10.87±0.49)%，表明 CoCl2能夠抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而影響細(xì)胞的復(fù)制，抑制其增殖．

2.3 CoCl2抑制SMYD3的轉(zhuǎn)錄

前人研究[10,13]已表明，SMYD3是雌激素受體重要的輔助因子，對于乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移具有十分重要的作用．Ren等[14]在雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231中干擾 SMYD3后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力受到明顯的抑制，且細(xì)胞周期被阻滯在了G0/G1期．

圖2 CoCl2對T47D細(xì)胞周期的影響Fig. 2 Influence of CoCl2 on cell cycle of T47D breast cancer cells

圖3 CoCl2對T47D細(xì)胞的周期分布比率的影響Fig. 3 Effect of CoCl2 on the cell distribution ratio of T47D cells

在此，首先在本實驗所用的雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞 T47D中就 SMYD3對細(xì)胞周期的影響情況進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖 4和圖 5所示．用特異性siRNA抑制內(nèi)源SMYD3表達(dá)后，T47D細(xì)胞同樣會發(fā)生 G0/G1期阻滯，表現(xiàn)出了與 CoCl2處理相類似的現(xiàn)象．因此，推測在 CoCl2誘導(dǎo) T47D 細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯、抑制細(xì)胞增殖的過程中，SMYD3很可能也牽涉其中．為驗證這一假設(shè)，通過熒光定量RT-PCR方法對不同濃度 CoCl2處理后 SMYD3的mRNA水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖6所示．

圖4 干擾SMYD3誘導(dǎo)T47D細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯Fig. 4 SMYD3 absence induced G0/G1 arrest in T47D breast cancer cells

圖5 干擾SMYD3周期分布圖Fig. 5 Ratio of cell distribution of SMYD3 absence

圖6 CoCl2對SMYD3轉(zhuǎn)錄的影響Fig. 6 Effect of CoCl2 on the transcription of SMYD3

由圖6可知：在CoCl2濃度大于100,μmol/L時，SMYD3的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P＜0.01)，至濃度達(dá)到400,μmol/L時，SMYD3的mRNA水平降到了對照細(xì)胞的1/5左右(0.20±0.12)．

2.4 過表達(dá)SMYD3抑制CoCl2對T47D細(xì)胞的作用

從圖 1—圖 6結(jié)果可以看出，CoCl2對 T47D細(xì)胞的缺氧損傷作用很可能與其對 SMYD3的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)．為進(jìn)一步驗證這一結(jié)論，將 SMYD3的過表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3轉(zhuǎn)入 T47D細(xì)胞使 SMYD3過表達(dá)(圖 7)，探究其是否可以抵消CoCl2對細(xì)胞的缺氧損傷作用．MTT檢測結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組相比，過表達(dá)SMYD3可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活力，并抑制 CoCl2對細(xì)胞的增殖抑制作用(圖 8)．

圖7 過表達(dá)SMYD3的mRNA水平Fig. 7 The mRNA level of overexpressed SMYD3

圖8 過表達(dá)SMYD3抑制CoCl2誘導(dǎo)的抗增殖作用Fig. 8 Effect of SMYD3 overexpression on CoCl2-induced antiproliferation in T47D breast cancer cells

進(jìn)一步檢測細(xì)胞周期(圖 9)發(fā)現(xiàn)：在過表達(dá)SMYD3與 CoCl2同時給藥 200,μmol/L時，G0/G1期細(xì)胞含量(56.05±0.72)%較單過表達(dá) SMYD3組(50.98±0.49)%有所升高，但比單加 200,μmol/L CoCl2組(64.21±1.46)%明顯降低，周期分布比率見圖10．結(jié)合MTT結(jié)果(圖8)，這些現(xiàn)象提示SMYD3的過表達(dá)可對 CoCl2誘導(dǎo)的缺氧損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，即SMYD3可提高癌細(xì)胞在缺氧條件下的存活能力．

圖9 SMYD3對CoCl2誘導(dǎo)的周期阻滯的影響Fig. 9 Effect of SMYD3 on CoCl2-induced cell cycle arrest

圖10 細(xì)胞周期分布比率圖Fig. 10 Ratio of cell distribution

3 討 論

SMYD3已被證實在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種癌組織中都有異常的高表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中表達(dá)量低[2]，這與腫瘤患者的存活率密切相關(guān)[7,,15]．Ren等[14]研究表明，敲低 SMYD3可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯，抑制其增殖；Tsuge等[16]認(rèn)為，SMYD3是 RB-E2F信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個下游靶點(diǎn)，5′-CCGCC-3′序列拷貝數(shù)降低將可能降低SMYD3與 E2F-1的親和力，從而使結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌發(fā)生幾率降低；還有研究[17]表明，SMYD3通過調(diào)控一系列靶基因及信號通路，參與到了肝癌與結(jié)腸癌的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進(jìn)程中，促使腫瘤惡化及轉(zhuǎn)移．此外，本課題組前期研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，SMYD3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，干擾SMYD3可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移[8]；過表達(dá) SMYD3可上調(diào)遷移標(biāo)志基因 MYL9，與 MRTF-A 協(xié)同促進(jìn)乳腺癌發(fā)生遷移[9]．由此可見，SMYD3已被視為是非常有潛力的腫瘤基因治療及藥物研發(fā)新靶點(diǎn)之一．

由于腫瘤細(xì)胞增殖迅速，周圍組織血管逐漸無法提供足夠的氧氣，而容易在腫瘤內(nèi)部形成缺氧微環(huán)境．缺氧會對細(xì)胞產(chǎn)生殺傷和抑制作用，例如：臨床上就有針對局部晚期腫瘤的 SFP(hypoxic antiblastic stop-flow perfusion)缺氧療法[20-21]，即通過充氣氣囊導(dǎo)管將腫瘤與血管隔離，截斷腫瘤的血氧供應(yīng)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞．然而，在低氧環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞會逐步改善自身基因表達(dá)情況，通過增強(qiáng)糖酵解代謝、促進(jìn)血管新生等方式，提升對缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力．這種缺氧微環(huán)境及與之相伴隨的代謝方式等的改變，是惡性腫瘤細(xì)胞中普遍存在的生化特征，被稱為瓦博格效應(yīng)[22]．盡管低氧糖酵解途徑較有氧的線粒體氧化磷酸化途徑產(chǎn)能效率低，但卻可為腫瘤細(xì)胞快速提供ATP以及細(xì)胞分裂增殖所必需的前體物質(zhì)，同時產(chǎn)生大量乳酸，形成酸性微環(huán)境，既可抵御免疫細(xì)胞、免疫分子及抗癌藥物的殺傷作用，還可分解破壞細(xì)胞基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移．因此，對低氧損傷的耐受能力增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移和對放化療抵抗的重要原因之一[23-24]．

CoCl2模擬腫瘤細(xì)胞低氧環(huán)境是體外誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧的經(jīng)典模型，研究表明 CoCl2可通過置換脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHD)輔因子中的 Fe2+，阻斷氧信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止 HIF-1α 被羥化，同時影響抑癌基因產(chǎn)物 pVHL結(jié)合 HIF-1α 氧依賴性降解區(qū)域(ODD)，從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi) HIF-1α 的表達(dá)，引起一系列細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)．因此，CoCl2得到了國內(nèi)外關(guān)于體外缺氧研究的廣泛應(yīng)用[25-28]．在本研究中，通過CoCl2來誘導(dǎo)缺氧環(huán)境，探究缺氧環(huán)境對人乳腺癌細(xì)胞 T47D增殖能力及細(xì)胞周期的影響機(jī)制．結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CoCl2誘導(dǎo)缺氧可引發(fā)細(xì)胞 G0/G1期阻滯、抑制癌細(xì)胞增殖，這一過程與其對SMYD3的轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān)，而人為過表達(dá)SMYD3則可緩解缺氧誘導(dǎo)的G0/G1期阻滯及增殖抑制效應(yīng)．這些結(jié)果表明：SMYD3對乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的推動作用，很可能與其提高細(xì)胞對缺氧環(huán)境的耐受能力有關(guān)．