張亞璇，王海洪，樊振川

(1.天津科技大學(xué)大健康生物技術(shù)研究所，天津市大健康生物技術(shù)國際聯(lián)合研究中心，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

脂肪酸合成代謝是生物細(xì)胞中的基礎(chǔ)代謝之一，是細(xì)胞膜形成的第一步，對細(xì)菌生理有關(guān)鍵作用．根據(jù)合成酶系統(tǒng)的差異，脂肪酸生物合成系統(tǒng)的酶被分為Ⅰ型脂肪酸合成酶系(FASⅠ)和Ⅱ型脂肪酸合成酶系(FASⅡ)[1-2]．烯酯酰ACP還原酶是Ⅱ型脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，它催化延伸反應(yīng)的最后一步，將反-2-烯酰 ACP還原為飽和酯酰 ACP[3]．最早被鑒定的烯酯酰 ACP還原酶基因是大腸桿菌(Escherichia coli)中的fabI，隨著基因組測序的完成，基因組信息揭示了苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)基因組中有這一基因的同源基因 fabI1和fabI2．這兩個基因都位于環(huán)狀的染色體上，fabI1由smc00005編碼，fabI2由 smc00326編碼[4-5]，與脂肪酸合成基因fabBA相鄰．它們與大腸桿菌FABI蛋白的相似度為51%,和50%,，且fabI2的序列與fabI1有66%,的一致性[6]，但兩個基因及相應(yīng)酶存在差異．

苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[7-8]是一類能與豆科苜蓿類植物共生形成根瘤的革蘭氏陰性細(xì)菌．目前對其研究主要集中在共生固氮機(jī)制和抗逆性兩個方面[9]，并證明了脂肪酸合成系統(tǒng)對苜蓿中華根瘤菌的共生固氮和抗逆性均有顯著影響，但對于基因 fabI2功能研究還未深入．本實(shí)驗(yàn)制備苜蓿中華根瘤菌烯酯酰 ACP還原酶基因 fabI2的抗體，是順利完成FABI2在蛋白水平表達(dá)模式以及FABI2與其他蛋白互作機(jī)制研究的重要前提，有利于進(jìn)一步對fabI2基因在脂肪酸合成中的功能進(jìn)行深入研究．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-blue、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存．pET-28b-FABI2質(zhì)粒為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王海洪教授提供．

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)所用的酶及相對應(yīng)的緩沖液、DNA相對分子質(zhì)量marker和蛋白marker，美國Thermo公司；Ni SepharoseTM6,Fast Flow、Glutathione SepharoseTM4B蛋白純化填料和 Protein A SepharoseTMCL-4B抗體純化填料，美國 GE Healthcare 公司；弗式完全佐劑和不完全佐劑，美國Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，美國Cell Signaling公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.1.3 試驗(yàn)動物

新西蘭大白兔 2只，普通級，體質(zhì)量 1.5～2.0,kg，由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供，許可證號為SCXK(京)2016-0003．

1.2 方法

1.2.1 pGEX-2T-FABI2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)帶有 BamHⅠ和 HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物從pET-28b-FABI2質(zhì)粒中擴(kuò)增目的片段，引物設(shè)計(jì)為上游引物加入 BamHⅠ酶切位：5′-ATGGATCCATG AACGGATTGATGAAC-3′，下游引物加入 HindⅢ酶切位點(diǎn)：5′-ATAAGCTTTTAATCCGCGTCTGCGAC-3′．反應(yīng)條件：95,℃ 2,min；95,℃ 30,s；56,℃ 30,s，30個循環(huán)；72,℃ 1,min；72,℃終延伸 15,min．利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，再用 BamHⅠ和HindⅢ分別將回收的目的基因片段、pGEX-2T載體進(jìn)行酶切；然后用 T4,DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)入E．coli XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) PCR、雙酶切驗(yàn)證后，篩選出符合要求的陽性克隆，并進(jìn)行測序鑒定．

1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

采用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將 pET-28b-FABI2和pGEX-2T-FABI2轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)，分別挑取單菌落至5,mL LB液體培養(yǎng)基(分別含100,μg/mL卡那霉素和 120,μg/mL氨芐青霉素)，37,℃搖床過夜培養(yǎng)．再以1∶50的比例放大培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時，加入0.1,mmol/L IPTG于20,℃、185,r/min條件下誘導(dǎo) 6,h使蛋白大量表達(dá)．4,℃、6,000,r/min離心5,min后收集菌體，用PBS溶液漂洗兩次后用細(xì)胞破碎儀超聲裂解 30,min．分別取誘導(dǎo)前、全蛋白、上清液和沉淀與 2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合后進(jìn)行 13%,SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)[10-11]．

1.2.3 融合蛋白的純化

6×His-FABI2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，將收集的菌體于裂解液(20,mmol/L NaH2PO4、200,mmol/L NaCl、20,mmol/L 咪唑)中超聲破碎，4,℃、12,000,r/min離心 15,min．取上清液用 0.45,μm 濾膜過濾后加入到預(yù)先用裂解液平衡好的Ni SepharoseTM6,Fast Flow純化柱中，室溫結(jié)合 1,h后，分別用含有50,mmol/L、100,mmol/L咪唑的裂解液進(jìn)行漂洗，除去結(jié)合不牢的蛋白．最后用含有 500,mmol/L咪唑的裂解液進(jìn)行洗脫，得到純化后的目的蛋白．將上述收集的流出液組分、漂洗液組分以及洗脫液組分分別用13%, SDS-PAGE檢測蛋白純度[12]．

pGEX-2T-FABI2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行超聲破碎，4,℃、12,000,r/min離心 15,min．取上清液過膜后加入到預(yù)先平衡好的 Glutathione SepharoseTM4B純化柱中，室溫結(jié)合1,h后，用10倍柱體積的裂解液(1×PBS)進(jìn)行漂洗，除去結(jié)合不牢的蛋白．最后用含有 20,mmol/L還原型谷胱甘肽的裂解液洗脫目的蛋白，得到純化后的目的蛋白．將上述收集的流出液組分、漂洗液及洗脫液組分分別用13%, SDS-PAGE檢測蛋白純度．

1.2.4 免疫

將純化后的 6×His-FABI2融合蛋白稀釋到1,mg/L，取 2,mL蛋白與等體積的弗氏佐劑混合后乳化完全，免疫新西蘭大白兔．采用頸背部多點(diǎn)注射法，初次免疫使用弗氏完全佐劑且免疫前進(jìn)行耳緣靜脈采血[13]作為陰性對照血清．之后每 10,d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用弗氏不完全佐劑，一共加強(qiáng)免疫 3次．最后 1次加強(qiáng)免疫后進(jìn)行耳緣靜脈采血，利用間接ELISA法測定抗血清的效價(jià)．效價(jià)合格后，股動脈采血，4,℃靜置過夜后收集血清，分裝凍存．

1.2.5 多克隆抗體效價(jià)的檢測

采用 ELISA法檢測抗血清的效價(jià)，以 GSTFABI2蛋白作為包被抗原，4,℃包被過夜，用 PBST洗3次以去掉結(jié)合不牢的蛋白．用5%,的脫脂乳粉封閉 1,h后，以所得的抗血清為一抗，一抗的稀釋倍數(shù)分別為 1∶1,000、1∶2,000、1∶4,000、1∶8,000、1∶16,000、1∶320,000、1∶640,000、128,000，HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗，稀釋倍數(shù)為 1∶20,000，最后經(jīng)過TMB顯色，測定450,nm處的吸光度，并計(jì)算出抗血清的效價(jià)．以實(shí)驗(yàn)組血清 A450與陰性對照血清A450的比值大于2即為陽性，其最高稀釋度即為抗血清的效價(jià)．

1.2.6 多克隆抗體的Protein A親合純化

由于 Protein A專一性吸附 IgG，可以去除 IgG之外的其他抗體分子，所以采用 Protein A對抗血清進(jìn)行親合純化．取 1,mL抗血清加入 13,mL 結(jié)合液(20,mmol/L Na2HPO4，pH 7.0)平衡血清．將平衡后的血清經(jīng) 0.45,μm 濾膜過濾后加入預(yù)先平衡好的純化柱中，室溫下與填料結(jié)合 30,min．結(jié)合完畢后放出流出液，用 0.1,mol/L 甘氨酸洗脫后得到純化后的抗體，經(jīng) 1,mol/L Tris-HCI(pH 9.0)調(diào)節(jié)洗脫液至中性后于-80,℃保存．

1.2.7 免疫印跡法檢測多克隆抗體的特異性

對 4次免疫后經(jīng) Protein A 純化后的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測多克隆抗體的特異性．樣品為誘導(dǎo)表達(dá)的另一標(biāo)簽抗原 GST-FABI2，將誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞超聲破碎后離心取上清液，進(jìn)行13%, SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后，用5%,脫脂乳粉封閉1,h．將純化后的多克隆抗體按一定的比例稀釋，稀釋度分別為 1∶300、1∶600、1∶1,000、1：1,200、1∶2,400、1∶4,800，室溫?fù)u床孵育1,h，PBST洗3次．將AP標(biāo)記的羊抗兔抗體稀釋 10,000倍后，室溫?fù)u床孵育 1,h，最后進(jìn)行 AP顯色．

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用 Excel 2010軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并制圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-2T-FABI2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

為了獲得 5′-末端攜帶 GST標(biāo)簽的 FABI2融合蛋白，構(gòu)建了 pGEX-2T-FABI2表達(dá)載體．以提取的pGEX-2T-FABI2質(zhì)粒為模板，用之前設(shè)計(jì)好的FABI2引物進(jìn)行 PCR驗(yàn)證和雙酶切驗(yàn)證，獲得條帶大小約為 807,bp的片段．最后經(jīng)測序驗(yàn)證序列完全正確，沒有突變位點(diǎn)，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖1).

圖1 fabI2的PCR驗(yàn)證和重組載體的雙酶切驗(yàn)證Fig. 1 PCR amplification of fabI2 and restriction identification of recombinant expression plasmids

2.2 6×His-FABI2和 GST-FABI2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

SDS-PAGE檢測重組表達(dá)載體 pET-28b-FABI2和pGEX-2T-FABI2在E．coli BL21(DE3)中的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示．由圖2可知，在0.1,mmol/L IPTG、20,℃、185,r/min條件下誘導(dǎo) 6,h后，含有 pET-28b-FABI2和 pGEX-2T-FABI2質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌株分別在約 2.8×104和 5.4×104處大量表達(dá)目的蛋白，且蛋白的表達(dá)主要集中在上清液．

圖2 SDS-PAGE檢測重組表達(dá)載體 pET-28b-FABI2 和pGEX-2T-FABI2在E. coli BL21(DE3)中的表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant vectors pET-28b-FABI2 and pGEX-2TFABI2 in E. coli BL21(DE3)

2.3 6×His-FABI2和GST-FABI2融合蛋白的純化

選用 6×His-FABI2融合蛋白作為免疫用抗原.將 6×His-FABI2融合蛋白破碎離心后取上清液，加入含有Ni SepharoseTM6,Fast Flow填料的重力柱中室溫結(jié)合1,h或者4,℃過夜．由于融合蛋白的His標(biāo)簽特異性與上述填料結(jié)合，最后經(jīng)過洗滌、洗脫等步驟可得到純度較高的目的蛋白，純度達(dá) 95%,以上(圖3(a))，作為免疫動物所用抗原．

GST-FABI2融合蛋白用于效價(jià)的測定和免疫印跡．將破碎后的 GST-FABI2 融合蛋白離心后取上清液，加入含有Glutathione SepharoseTM4B填料的純化柱中進(jìn)行親和純化，經(jīng)20,mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫后得到目的蛋白(圖3(b))．

圖3 pET-28b-FABI2重組蛋白和 pGEX-2T-FABI2重組蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant proteins pET-28b-FABI2 and pGEX-2T-FABI2

2.4 抗血清效價(jià)的檢測

用純化得到的6×His-FABI2蛋白免疫新西蘭大白兔，4次免疫后從耳緣靜脈處取少量血，室溫靜置2,h或4,℃過夜后獲得析出血清，通過ELISA法測定抗血清的效價(jià)，利用酶標(biāo)儀測定A450后計(jì)算抗血清的效價(jià)，結(jié)果如圖4所示．由圖4可知1號兔抗血清的效價(jià)大于128,000，2號兔抗血清效價(jià)大于256,000．

圖4 間接ELISA法測定抗血清的效價(jià)Fig. 4 ELISA test results of anti-FABI2 polyclonal antiserum

2.5 免疫印跡法檢測抗血清靈敏度和特異性

本研究對4次免疫后經(jīng)過Protein A純化的抗血清進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果如圖 5所示，在 5.4×104處出現(xiàn)單一的特異性條帶，證明抗血清與 FABI2蛋白特異性結(jié)合良好．

圖5 免疫印跡法驗(yàn)證抗體特異性Fig. 5 Antibody specificity detected by Western blot

3 結(jié) 語

設(shè)計(jì)帶有 BamHⅠ和 HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物，從實(shí)驗(yàn)室已有的 pET-28b-FABI2質(zhì)粒中擴(kuò)增出目的片段后，構(gòu)建帶有 GST標(biāo)簽的表達(dá)載體．通過摸索合適的誘導(dǎo)條件，發(fā)現(xiàn)在 0.1,mmol/L IPTG、20,℃、185,r/min條件下誘導(dǎo) 6,h，pET-28b-FABI2和 pGEX-2T-FABI2質(zhì)粒分別在2.8×104和5.4×104處大量表達(dá)蛋白，且集中在上清液中．由于表達(dá)的蛋白為水溶性，因此純化得到的融合蛋白空間結(jié)構(gòu)完好．除此之外，選擇 6×His-FABI2融合蛋白作為免疫用抗原，由于其標(biāo)簽相對分子質(zhì)量小，因此與 GST標(biāo)簽相比而言，免疫動物產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更?。?次免疫后測效價(jià)，合格后股動脈取血．最后對血清進(jìn)行Protein A親和純化并進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血清可與 FABI2蛋白特異性結(jié)合，標(biāo)志著多克隆抗體制備成功．在進(jìn)行免疫印跡法檢測時，以所得的抗體為一抗，另一個標(biāo)簽的抗原進(jìn)行上樣，排除了His標(biāo)簽產(chǎn)生的抗體對標(biāo)簽的識別作用．后續(xù)將會采用免疫熒光技術(shù)對該抗體進(jìn)行定位．