劉曉，姜竹茂，余志堅(jiān)，周梅，張頌，劉花蘭，劉婕

（1煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264005；2東君乳業(yè)（禹城）有限公司，山東 禹城 251200）

0 引 言

山羊奶中富含200多種營(yíng)養(yǎng)素和生物活性物質(zhì)[1]，被視為乳中精品。它具有獨(dú)特的保健功效，有養(yǎng)顏美容、抗衰老等功效。干酪乳桿菌作為益生菌的一種，能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制[2]。在進(jìn)入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活，起到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收的作用[3]。干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵羊奶飲料，不僅降低羊奶膻味，深受消費(fèi)者喜愛(ài)；而且它具有抗衰老、延年益壽、促進(jìn)消化道蠕動(dòng)，減少便秘等功效。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于發(fā)酵型羊奶飲料的文獻(xiàn)較少，秦立虎[4]等人以新鮮羊奶為主要原料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵,添加櫻桃果汁等配制櫻桃活性乳酸菌羊奶飲料。在美國(guó)、日本、韓國(guó)以及臺(tái)灣地區(qū)，該產(chǎn)品工業(yè)化較多，尤其以養(yǎng)樂(lè)多為代表，在臺(tái)灣地區(qū)該類(lèi)型產(chǎn)品幾乎與酸奶市場(chǎng)份額相當(dāng)，近幾年國(guó)內(nèi)該類(lèi)型產(chǎn)品的產(chǎn)量逐年上升，養(yǎng)樂(lè)多、味全、蒙牛等公司都先后推出自己的褐色乳飲料，可見(jiàn)其市場(chǎng)前景良好[5]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 材料

干酪乳桿菌，嗜熱鏈球菌，脫脂奶粉，全脂羊奶粉，白砂糖，高脂果膠，蔗糖酯，羧甲基纖維素鈉（簡(jiǎn)稱(chēng)CMC）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平、臺(tái)式離心機(jī)、pH計(jì)等。

1.2 工藝流程

1.3 操作要點(diǎn)

（1）菌種活化[6]。將脫脂奶粉用蒸餾水配制成12%的復(fù)原乳，在115℃滅菌15 min，冷卻至40℃，在無(wú)菌條件下，分別接種干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至凝乳。干酪乳桿菌發(fā)酵劑和嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑培養(yǎng)溫度分別為37℃和42℃，進(jìn)行3次活化使其活力充分恢復(fù)后，即可作為酸奶發(fā)酵劑。

（2）脫脂[7]。利用離心旋轉(zhuǎn)的方法進(jìn)行脫脂，轉(zhuǎn)速是2 000 r/min離心20 min脫脂。

（3）均質(zhì)[8]。均質(zhì)壓力18～20 MPa，溫度為50℃。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 酸度的測(cè)定[9-10]

測(cè)定方法參考《GB5413.34-2010》。測(cè)定時(shí)用濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定法，吉爾涅爾度°T表示。

1.4.2 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定[11]

測(cè)定方法參照《GB4789.2-2010》，利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)發(fā)酵酸乳中活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵的羊奶飲料用滅菌的0.9%的生理鹽水梯度稀釋?zhuān)?dāng)稀釋到一定的倍數(shù)后，取0.1 mL的菌液在MRS培養(yǎng)基涂布計(jì)數(shù)，37℃培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)量[12-13]。

1.4.3 沉淀離心率的測(cè)定[14]

在10 mL離心管中加入添加羊奶飲料，置于離心機(jī)中以3 000 r/min離心10 min，根據(jù)以下公式計(jì)算離心沉淀率：

1.4.4 感官評(píng)價(jià)[15]

選擇10名從事食品專(zhuān)業(yè)研究的人員組成評(píng)定小組，對(duì)發(fā)酵型酸羊奶飲料的感官質(zhì)量從色澤、滋味、氣味、穩(wěn)定性4個(gè)方面評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 產(chǎn)品感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與討論

2.1 原料乳殺菌工藝的確定

羊奶中的蛋白質(zhì)等氨基化合物和葡萄糖或其他羰基化合物之間在正常的狀態(tài)下并不會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，只有當(dāng)熱處理時(shí)間較長(zhǎng)，溫度較高時(shí)才發(fā)生明顯的美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物使產(chǎn)品呈現(xiàn)褐色，并賦予產(chǎn)品獨(dú)特的香氣[16]。對(duì)于幾種殺菌工藝效果比較后，結(jié)果如表2所示。

表2 原料乳不同殺菌工藝參數(shù)效果的比較

一般酸奶制作的殺菌條件是：85℃，30 min或95℃，5 min，由于本試驗(yàn)中干酪乳桿菌采用的是長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，因而在原料乳殺菌時(shí)更應(yīng)殺滅所有的致病菌以免引起雜菌污染現(xiàn)象。因此原料乳殺菌工藝參數(shù)的選擇就顯得至關(guān)重要。從表2中可以看出，凝乳I、II顏色太淺，凝乳V顏色過(guò)深，而凝乳III、IV在顏色上較相近且容易被消費(fèi)者接受。所以選擇工藝III作為最后的殺菌工藝，即滅菌條件為115℃，15 min。

2.2 發(fā)酵工藝

2.2.1 發(fā)酵劑接種量的確定

接種量除能引起酸奶口感上的酸度差異之外，還會(huì)影響酸奶的組織狀態(tài)與風(fēng)味[17]。利用嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌你的共生關(guān)系和嗜熱鏈球菌的產(chǎn)酸特性，在添加2%的嗜熱鏈球菌的基礎(chǔ)上，添加2%（體積分?jǐn)?shù)）、3%、4%、5%、6%的干酪乳桿菌。通過(guò)測(cè)定酸羊乳在發(fā)酵結(jié)束后和后熟24 h后的酸度、活菌數(shù)以及制成乳酸菌飲料后的感官評(píng)價(jià)得出酸乳的最優(yōu)工藝條件。對(duì)于幾種接種量發(fā)酵效果比較后，結(jié)果如表3所示。

表3 發(fā)酵劑不同添加量對(duì)產(chǎn)品的影響

由表3可以看出，2%的嗜熱鏈球菌與5%和6%的干酪乳桿菌組合發(fā)酵制作的乳酸菌飲料酸度和活菌數(shù)最高。發(fā)酵前期，嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)速度較快，能迅速發(fā)酵產(chǎn)酸，產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物能促進(jìn)干酪乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖。發(fā)酵中后期，在高酸度的基料中，嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，干酪乳桿菌占據(jù)發(fā)酵的主導(dǎo)地位、繁殖較快。2%的嗜熱鏈球菌與4%、5%和6%的干酪乳桿菌組合發(fā)酵制作的羊奶飲料感官評(píng)分較高。結(jié)合以上分析從而確定最佳發(fā)酵劑添加量為：2%的嗜熱鏈球菌與5%的干酪乳桿菌進(jìn)行組合發(fā)酵。

2.2.2 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

羊奶飲料酸甜可口，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，其酸度的來(lái)源主要為乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸，當(dāng)生產(chǎn)中酸度不足以使產(chǎn)品達(dá)到相應(yīng)的酸度時(shí)，通常會(huì)使用檸檬酸調(diào)節(jié)到需要的酸度，但這勢(shì)必會(huì)影響到發(fā)酵基料中的活菌數(shù)量和乳蛋白的充分降解，也會(huì)最終影響到飲料產(chǎn)品的益生功能和保健功效[18]。所以合適的發(fā)酵時(shí)間是羊奶飲料發(fā)酵達(dá)到最佳酸度的一個(gè)重要影響因素。因此本實(shí)驗(yàn)在2%的嗜熱鏈球菌與5%的干酪乳桿菌進(jìn)行組合發(fā)酵時(shí)，選取10，15，20，25，30 h五個(gè)不同的發(fā)酵時(shí)間，結(jié)果如表4所示。

表4 不同發(fā)酵梯度對(duì)產(chǎn)品的影響

結(jié)果表明，2%的嗜熱鏈球菌與5%的干酪乳桿菌進(jìn)行組合發(fā)酵時(shí)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為25 h時(shí)，其活菌數(shù)、酸度和感官等分最高，所以羊奶飲料的最佳發(fā)酵時(shí)間是25 h。

2.3 穩(wěn)定劑的確定

2.3.1 高酯果膠對(duì)乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響

果膠是由D-半乳糖醛酸殘基經(jīng)α-(1,4)糖苷鍵相連接聚合而形成的酸性大分子多糖，根據(jù)酯化度的不同，稱(chēng)為高甲氧基果膠和低甲氧基果膠。果膠在酸性乳飲料中能與酪蛋白所帶正電荷發(fā)生靜電作用，形成親水性復(fù)合物，避免顆粒間的聚合作用，使酪蛋白膠束顆粒得以穩(wěn)定地分散。高酯果膠作為酸性乳飲料中優(yōu)良的穩(wěn)定劑，目前在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的研究[19]。

圖1 高脂果膠添加量對(duì)乳酸菌飲料穩(wěn)定性和感官品質(zhì)的影響

從圖1中可以看出，隨著高脂果膠添加量的增加，產(chǎn)品離心沉淀率出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。產(chǎn)品的感官得分隨高脂果膠添加量的增加先上升，當(dāng)添加量為0.1%時(shí)，出現(xiàn)最大值為84。但當(dāng)高脂果膠的添加量超過(guò)一定量時(shí)，調(diào)配液黏度太大，冷卻后有凝膠出現(xiàn)，與發(fā)酵乳混合均質(zhì)后的口感欠佳且過(guò)于黏稠。當(dāng)高脂果膠的添加量為0.125%時(shí)，產(chǎn)品的離心沉淀率為3.9%，感官得分大于80，因此選擇此添加量為高脂果膠添加量的最佳水平。

2.3.2 蔗糖酯對(duì)乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響

乳飲料中主要的不穩(wěn)定物質(zhì)是脂肪和蛋白質(zhì)。脂肪與水互不相溶，易發(fā)生分離而出現(xiàn)分層現(xiàn)象，加入乳化劑后，能夠形成具有外親水結(jié)構(gòu)的固體—乳化劑雙層，生成可再溶劑化的粒子，使飲料穩(wěn)定性增強(qiáng)[20]。

圖2 蔗糖酯添加量對(duì)乳酸菌飲料穩(wěn)定性和感官品質(zhì)的影響

由圖2可以看出，隨著蔗糖酯添加量的增加，飲料的離心沉淀率大幅度下降，當(dāng)添加量大0.15%時(shí)，下降的程度不明顯。產(chǎn)品的感官得分隨蔗糖酯添加量的增加先上升，當(dāng)添加量為0.15%時(shí)，出現(xiàn)最大值，后隨著添加量的增加而下降。因此選擇蔗糖酯最佳添加量水平為0.15%。

2.3.3 CMC對(duì)乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響

羧甲基纖維素鈉(CMC)，是一種陰離子多糖。在酸性條件下，它與酪蛋白發(fā)生吸附，提供靜電排斥和空間位阻作用，同時(shí)CMC可使體系黏度增加，起到穩(wěn)定作用[21]。因而被廣泛應(yīng)用到乳酸飲料中。

圖3 CMC添加量對(duì)乳酸菌飲料穩(wěn)定性和感官品質(zhì)的影響

產(chǎn)品的離心沉淀率隨著CMC添加量的增加先出現(xiàn)大幅度下降，當(dāng)添加量大0.15%時(shí)，下降的程度不明顯。產(chǎn)品的感官得分隨CMC添加量的增加先上升，當(dāng)添加量為0.15%時(shí)，出現(xiàn)最大值，0.15%之后隨著添加量的增加而下降。當(dāng)CMC添加量0.15%時(shí)，離心沉淀率為3.9%，感官得分為82。此時(shí)產(chǎn)品口感適中，無(wú)黏稠感，風(fēng)味純正，離心后沉淀量少。因此選擇CMC最佳添加量水平為0.15%。

2.3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以高脂果膠、蔗糖酯、CMC最佳添加量分別作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的1、2和3水平。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（33）正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)品的沉淀率和感官得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)極差和方差分析獲得最佳工藝條件。

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析

正交實(shí)驗(yàn)的因素水平如表5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析如表6所示。由表6可以看出，在提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性方面，穩(wěn)定劑的最佳配比為A1B2C2，即高脂果膠的添加量為0.0125%，蔗糖酯的添加量為0.03%，CMC的添加量0.03%。采用直觀分析法比較3個(gè)因素的R值可知，各穩(wěn)定劑的添加量對(duì)飲料穩(wěn)定性的影響程度由大到小的順序?yàn)楦咧z＞CMC＞蔗糖酯。采用直觀分析方法，比較3個(gè)因素的R值可以看出：各穩(wěn)定劑的添加量對(duì)感官品質(zhì)的影響程度為高脂果膠影響程度最大，其次是CMC和蔗糖酯，且兩者的R值相差不大。

由上述分析可知，在獲得產(chǎn)品的最佳穩(wěn)定效果和感官品質(zhì)方面，正交優(yōu)化試驗(yàn)得到的最佳配比均為A1B2C2，即高脂果膠的添加量為0.0125%，蔗糖酯的添加量為0.03%，CMC的添加量0.03%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在115℃（15 min）下對(duì)復(fù)原羊奶進(jìn)行殺菌后，添加5%的干酪乳桿菌和2%的嗜熱鏈球菌進(jìn)行組合發(fā)酵，最佳的發(fā)酵時(shí)間為25 h。在復(fù)合穩(wěn)定劑最優(yōu)配比的條件下(高脂果膠、蔗糖酯、CMC的添加量分別為0.0125%，0.03%，0.03%)所制備的干酪乳桿菌羊奶飲料褐色適中、有濃郁的發(fā)酵乳香氣和美拉德反應(yīng)風(fēng)味，感官得分為89。最終測(cè)得產(chǎn)品離心沉淀率為2.38%，活菌數(shù)高達(dá)4.7×108mL-1，生產(chǎn)周期縮短為24 h左右。

3 結(jié)論

針對(duì)干酪乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵乳飲料發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)，前期易染雜菌的問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)，利用嗜熱鏈球菌與干酪乳桿菌的共生作用，研制出了一款活性干酪乳桿菌羊奶飲料。

從凝乳顏色、口感指標(biāo)等方面綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)最終確定最佳殺菌條件為115℃，15 min；從活菌數(shù)、感官得分方面，最佳發(fā)酵劑接種量為在2%嗜熱鏈球菌的基礎(chǔ)上添加5%的干酪乳桿菌，最佳的發(fā)酵時(shí)間為25h。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)得到了干酪乳桿菌羊奶飲料穩(wěn)定劑的最佳復(fù)配比為：高脂果膠的添加量為0.0125%，蔗糖酯的添加量為0.03%，CMC的添加量0.03%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)品褐色適中，有濃郁的發(fā)酵乳香味，感官得分為89。最終測(cè)得產(chǎn)品離心沉淀率為2.38%，活菌數(shù)高達(dá)4.7×108mL-1。