于愛軍 趙魯文 陳凱 劉金龍 傅華 李劍

【摘? 要】目的：研究結直腸癌組織中podoplanin標記微淋巴管的特點，探討其與腫瘤淋巴結轉移的關系。方法：收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術切除結直腸癌和癌旁組織標本34例及正常結直腸組織標本20例，用MaxVision法免疫組織化學染色檢測podoplanin表達，計算podoplanin標記的微淋巴管密度（MLVD），并結合結直腸癌臨床病理特征進行相關性分析。結果：結直腸癌旁MLVD（22.53±4.93）明顯高于腫瘤中心區(qū)（7.44±1.78）（P<0.01），兩者均明顯高于正常結直腸組織（5.40±1.88）（P<0.01）。結直腸癌旁高MLVD與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期（P<0.01）有關，與患者的性別、年齡均無關。結論：結直腸癌旁高MLVD與腫瘤組織的淋巴結轉移密切相關。腫瘤旁MLVD是判斷腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移的重要指標。

【關鍵詞】結直腸癌;Podoplanin;淋巴結轉移;微淋巴管密度;免疫組織化學

結直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，其發(fā)病率在我國高居惡性腫瘤第三位。淋巴道轉移是其轉移的主要途徑，大多數(shù)結直腸癌早期就可以發(fā)生淋巴轉移^[1]。近年來隨著新型淋巴管標記物的出現(xiàn)，腫瘤新生淋巴管形成與腫瘤轉移的關系逐漸成為研究的熱點。本研究運用免疫組織化學方法檢測Podoplanin在34例結直腸癌中的表達，計算結直腸癌中微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density， MLVD），探討它們與結直腸癌淋巴結轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院2017年5月～2018年5月手術切除結直腸標本34例，其中男性20例，女性14例;年齡35～78歲，中位年齡53.6歲。組織學分型：高分化腺癌8例、中分化腺癌16例、低分化腺癌10例。臨床Dukes分期： A+B期18例、C+D期16例。全部病例術前均未行化療或放療，術后均經病理確診。每例標本取結直腸癌、癌旁組織（距瘤緣小于1cm）各1塊。另外隨機選取其中20例距離腫瘤10cm以上遠的組織作為正常對照。

1.2方法

全部標本經4%甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片（厚4μm）、常規(guī)HE染色及免疫組化MaxVision兩步法染色。兔抗人Podoplanin單克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，MaxVision試劑盒購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，操作按照試劑盒說明書進行。抗原修復采用EDTA（PH8.0）高壓鍋高溫修復，DAB顯色，中性樹膠封片。

1.3 淋巴管計數(shù)

Podoplanin陽性染色定位于淋巴管內皮細胞的細胞質，呈棕黃色顆粒狀。參照Weidner報道的方法對微淋巴管密度進行計數(shù)，Podoplanin染色后，單個內皮細胞或內皮細胞簇著色陽性分別計為一個陽性微淋巴管，不一定要找到完整的管狀結構，先在低倍鏡（×40倍）下分別選取結直腸癌周邊區(qū)、中心區(qū)以及正常結直腸組織Podoplanin染色陽性微淋巴管最豐富的區(qū)域，即“熱點（hot spots）”，然后在高倍鏡（×200）視野下計數(shù)MLVD，每例計數(shù)3個視野，并求其均值^[2]。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據均用SPSS for Windows 18.0統(tǒng)計軟件分析處理，所有計數(shù)資料用表示，組間比較用t檢驗，檢驗水準為α=0.01。

2 結果

2.1 結直腸癌及癌旁組織中微淋巴管形態(tài)特征及淋巴管密度分析

結直腸癌旁組織MLVD明顯高于癌及正常組織（表1），癌組織內淋巴管多塌陷、閉塞，少量為狹窄的腔隙，癌旁組織淋巴管管腔形狀不規(guī)則，多有不同程度的擴張，腔內有時可見少量淋巴細胞，偶見有癌細胞。正常組織中淋巴管分布于粘膜層、粘膜下層、肌層和外膜中，形態(tài)大小不一，壁較薄。

2.2 結直腸癌組織中淋巴管密度與臨床病理因素的關系

結直腸癌中心區(qū)MLVD與結直腸癌臨床病理各因素之間無相關性。但在結直腸癌旁MLVD與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期（P<0.01）有關，而與患者性別、年齡均無關（表2）。

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特征，也是臨床治療失敗、致死的主要原因之一^[3]。在實體惡性腫瘤中， 淋巴系統(tǒng)可能早于血液系統(tǒng)，成為腫瘤轉移的最初途徑^[4]。在腫瘤生長的早期，尤其是轉移瘤生長早期，其營養(yǎng)物質的提供主要靠彌散方式及微淋巴管、新生淋巴管通過擴張形式提供，且隨著腫瘤生長淋巴管數(shù)量也在增加，管壁結構發(fā)生改變^[5]，因此惡性腫瘤淋巴轉移過程中起關鍵作用的是淋巴管的生成。由于以前缺乏特異的淋巴管標志物，長期以來，對腫瘤淋巴管的研究相對滯后于對腫瘤血管的研究，隨著近年來相繼發(fā)現(xiàn)了腎小球足突細胞膜黏蛋白（Podoplanin），血管內皮生長因子受體（VEGFR）-3，腫瘤胚胎性抗原M-A的單克隆抗體（D2-40），淋巴管內皮透明質酸受體（LYVE）-1等能特異性標記淋巴管內皮細胞的抗體，極大地方便了對淋巴管與腫瘤關系的研究。淋巴管生成也成為腫瘤研究新的熱點， 抑制腫瘤新生淋巴管為控制腫瘤淋巴道轉移提供了新的靶點^[6]。

Podoplanin首先在患有嘌呤霉素所誘導的腎病鼠模型的腎小球足突細胞表面發(fā)現(xiàn)，是分子量為43KD的Ⅰ型黏液樣跨膜糖蛋白，由166個氨基酸構成，有一個單一高度保守的跨膜區(qū)域，胞內域有9個氨基酸構成，胞質內的C端有兩個潛在的磷酸化位點，胞外域有一個相對保守的6個潛在的氧連接型糖基化位點^[7]。Podoplanin主要表達于生長中和成熟的淋巴管內皮細胞表面，在血管內皮細胞上不表達，是特異性較強的淋巴管內皮細胞標記物^[8]。本研究結果顯示，未在由Podoplanin標記的微淋巴管內發(fā)現(xiàn)紅細胞，有的微淋巴管內可見淋巴細胞，少數(shù)微淋巴管內可以發(fā)現(xiàn)癌栓，血管內皮細胞均未表達，這表明Podoplanin標記微淋巴管的特異性和敏感性較好。

Schoppmann等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內新生淋巴管由單層內皮細胞構成，缺乏連續(xù)的基底膜，內皮細胞連接疏松，有許多潛在腔隙，通透性增加，從而使腫瘤細胞容易進入淋巴管，形成淋巴轉移^[9]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中大多數(shù)是由單層內皮細胞構成的淋巴管，這些內皮細胞間的連接稀疏，存在很多潛在腔隙。癌旁組織的MLVD高于癌組織及正常組織，差異有統(tǒng)計學意義，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義。結直腸癌中MLVD與淋巴結轉移有關，微淋巴管的形成為腫瘤轉移提供了有利條件。雖然已經證明癌組織中存在新生淋巴管，但癌組織與癌旁淋巴管形態(tài)存在明顯差異，腫瘤內部淋巴管多因腫瘤細胞的擠壓而導致塌陷、閉塞，癌旁組織的淋巴管的形態(tài)大多數(shù)是增生擴張的。腫瘤內部淋巴管可能沒有功能，功能性淋巴管主要位于癌旁，由于癌旁增生的功能性淋巴管增加了腫瘤細胞與淋巴管接觸的面積，從而促使了腫瘤的淋巴轉移^[10]。

本研究顯示，Podoplanin可以特異性標記淋巴管上皮細胞，結直腸癌癌旁MLVD與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期顯著相關，新生淋巴管在腫瘤轉移過程中有重要作用。檢測腫瘤及癌旁組織內MLVD可以作為評估結直腸癌生物學行為的一項指標。檢測MLVD可能有助于評估結直腸癌患者的預后并指導臨床治療。

參考文獻

[1]裴永彬，劉云，張學明，等. 新生淋巴管在結直腸癌淋巴結轉移中的研究進展[J]. 河北醫(yī)科大學學報，2013，34（1）：113-117.

[2]Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer[J]. Am J Pathol， 1995， 147（1）： 9-19

[3]陶麗，朱瑩杰，顧纓，等. ARHGAPs分子與結直腸癌侵襲及轉移關系的研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2018，26（9）：1450-1454.

[4]李爽，朱旭紅. 腫瘤新生淋巴管生成與腫瘤淋巴轉移[J]. 腫瘤防治研究， 2012， 39（11）： 1388-1391.

[5]張林西，郭穎，白美玲. 新生血管、淋巴管在結直腸癌進展中的作用[J]. 中國老年學雜志，2016，36（5）：1116-1118.

[6]李永生， 余昌俊， 李勇.腫瘤微淋巴管的研究進展[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1245-1248.

[7]Raica M， Cimpean AM， Ribatti D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis[J]. Anticancer Res， 2008， 28（5B）： 2997-3006.

[8]朱寶成，周彩芳，彭志勇.Podoplanin及血管內皮生長因子受體-3在結直腸癌中表達的研究[J]. 哈爾濱醫(yī)科大學學報，2018，52（2）：142-144.

[9]Schoppmann SF，Bayer G，Aumayr K，et al.Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer[J].Ann Surg.2004，240（2）：306-312.

[10]李潔明， 鄭林輝， 李太原.結直腸癌邊緣區(qū)微淋巴管密度及VEGF-C表達的意義[J].江西醫(yī)藥，2012，47（9）：753-756.