常燕楠 劉潔 梁金太

【摘 要】 PAL是催化直接脫掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶，是一個可把苯丙氨酸用于酚類化合物合成的酶。本文利用電子克隆技術(shù)獲得一個馬鈴薯PAL基因的cDNA序列，運用多種生物信息學(xué)方法對其進行初步分析。從核酸序列到氨基酸序列，再到蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測，獲得了該基因的電子克隆全長。結(jié)果表明：該序列全長2529bp，共編碼722個氨基酸，有多個限制性酶切位點，有38個磷酸化位點，屬于親水性氨基酸，無信號肽，無膜穿透性，無保守結(jié)構(gòu)域。文末對下一步的實驗驗證和功能分析進行了展望，為進一步研究該基因在馬鈴薯特別是在抗病性的功能提供相關(guān)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 馬鈴薯； PAL； 生物信息學(xué)

[Abstract] Pal is an enzyme that catalyzes the direct removal of ammonia from L-phenylalanine and the formation of trans-cinnamic acid. It is an enzyme that can use phenylalanine for the synthesis of phenolic compounds. In this paper， the cDNA sequence of a potato pal gene was obtained by using electronic cloning technique， and the cDNA sequence was preliminarily analyzed by various bioinformatics methods. From nucleic acid sequence to amino acid sequence to advanced structure prediction of protein， the full length of electronic clone of this gene was obtained. The results showed that the sequence was 2529bp， encoding 722 amino acids， with multiple restriction endonuclease sites and 38 phosphorylation sites， which was hydrophilic. Amino acids， no signal peptide， no membrane penetration， no conserved domain. At the end of the paper， the future experimental verification and functional analysis were prospected， which provided the relevant basis for further study of the function of the gene in potato， especially in resistance to disease.

[Keywords] potato； pal； Bioinformatics

1961年苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase， PAL）首次在綠色植物中被發(fā)現(xiàn)。隨著更加深入的研究，該酶已逐步被固定化，并且已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)苯丙氨酸[1]。苯丙素類生物合成（又稱一般苯丙氨酸途徑）需要一系列核心酶調(diào)控，PAL是一般苯丙氨酸途徑的切入點酶，它將L-苯丙氨酸（L-Phe）從初級代謝反應(yīng)引入到反式肉桂酸（t-CA））的合成過程中[2]。生成的t-CA被進一步轉(zhuǎn)化為許多種芳香族化合物，統(tǒng)稱為聚酚類化合物，在植物中已鑒定出8000多種芳香族代謝物，包括苯烯類化合物、香豆素、黃酮、黃酮醇、二苯乙烯、羥基肉桂酸鹽、木質(zhì)素和大分子木質(zhì)素。這個大型芳香化合物家族實現(xiàn)了許多對植物生長，發(fā)育和植物與環(huán)境相互作用至關(guān)重要的生理功能[3]。

PAL在植物生理代謝方面具有重要意義，比如木質(zhì)素是細胞次生壁的一種結(jié)構(gòu)成分，它給植物細胞提供機械支持，并產(chǎn)生了一個疏水性環(huán)境，這對于植物傳導(dǎo)水分和養(yǎng)分十分重要[4]。黃酮類和花青素類物質(zhì)這些聚酚類化合物可作為抗病原性植物抗毒素劑、抗氧化劑直接保護植物免受生物和非生物脅迫，或作為介導(dǎo)植物與微生物相互作用的信號分子。同時，經(jīng)該途徑產(chǎn)生的黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)與植物根瘤菌有趨化作用，有些類黃酮化合物還可以誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤基因[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，許多植物在嚴(yán)寒、機械損傷、病原菌微生物感染等逆境條件下，植物的苯丙素類代謝被迅速激活，PAL活性迅速上升。PAL活性可作為一個生理指標(biāo)以指示植物的抗逆能力[5]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PAL參與提高植物抗病性的化合物的合成，比如植保素、木質(zhì)素和酚類物質(zhì)等。PAL已被證實可以間接參與植物抗蟲性，比如苯丙素類代謝途徑的產(chǎn)物之一木質(zhì)素使植物細胞壁加厚，木質(zhì)化程度增加，對食草類動物形成一道機械障礙。草食性昆蟲在取食植物時會受到苯丙素類代謝途徑的另一代謝產(chǎn)物植保素地毒害作用和趨避作用[1]。因此，研究植物苯丙素類生物合成及其調(diào)控機制具有重要的現(xiàn)實意義和實際應(yīng)用價值。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是全球四大糧食作物之一，在一定程度上可以保障我國的糧食安全[6]，2015年，農(nóng)業(yè)部提出我國馬鈴薯主食化戰(zhàn)略，為國家糧食安全提供更多保障[7]。馬鈴薯青枯病是馬鈴薯第二大病害，嚴(yán)重威脅馬鈴薯品質(zhì)和產(chǎn)量[8]。段江燕等發(fā)現(xiàn)，PAL 活性可以作為青枯菌侵染馬鈴薯的生理生化指標(biāo)[9]。

本實驗室在馬鈴薯與青枯菌互作過程中提取出來的一條EST，經(jīng)過NCBI 堿基同源性BLAST初步分析，判斷這條EST是馬鈴薯PAL（phenylalanine ammonia-lyase-like（LOC102596017）， mRNA）基因，并推斷它參與馬鈴薯青枯病的抗性，本文利用相關(guān)的軟件及在線服務(wù)器對該EST進行一系列生物信息學(xué)分析，以期能為其后續(xù)功能研究及實際應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PAL基因的電子克隆

以本實驗室前期獲得的一條EST為探針，在NCBI的Genbank庫中通過Blastn搜尋同源序列，在檢索結(jié)果中選取 1 條 Query cover 高、E 值低的序列作為subject序列，通過用Bioedit軟件將subject序列與原始Query序列進行比對分析，以subject序列為模板進行組裝和衍生Query序列。直到克隆拼接后的序列能夠完整翻譯。將拼接完成的新基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對搜索，確認為新基因序列。

1.2 PAL基因的序列分析

生物信息學(xué)分析方法涉及的數(shù)據(jù)庫有：NCBI；主要軟件有Bioedit、Visual Studio、MEGA 7；網(wǎng)絡(luò)程序有ORFfinder、ExPASy、SMART、TMHMM、SignalP、NetPhos、NetNES、HNN、CPHmodels 具體如（表1）。

1.3 PAL基因的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)該基因與馬鈴薯PAL序列的同源性為99%，為了進一步研究該基因與PAL之間的進化關(guān)系，選取了同源性最相近的21條序列進行同源進化比對，其中包括了馬鈴薯、番茄、辣椒和煙草中提取的序列，利用MEGA7軟件構(gòu)建同源進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL基因全長的獲取

在ORFfinder中查找該EST的潛在ORF可得ORF起始于第137位堿基，結(jié)束大于487位堿基，據(jù)此推測該EST尚不完整，需要對其克隆全長。以在NCBI中檢索出的一條subject序列（登錄號：LOC102596017）為模板對其進行拼接。拼接好的序列如下（見圖1）。

2.2 PAL蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ExPASy對蛋白質(zhì)一級序列進行基本分析，結(jié)果表明：該基因表達的蛋白分子式為C3437H5533N965O1064S33，氨基酸數(shù)為722，分子量為78.5kDa，理論等電點為6.03，屬酸性類型。帶負電殘基的總數(shù)（Arg+ Lys）為81，帶正電殘基總數(shù)（Arg+ Lys）為72；不穩(wěn)定系數(shù)為35.03，小于40，為穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為90.66，為脂溶性蛋白；平均親水系數(shù)為-0.187，為水溶性蛋白。該蛋白由20種氨基酸組成，其中含量最豐富為亮氨酸（Leu），最少為色氨酸（Trp）。

2.3 亞細胞定位和跨膜區(qū)分析

利用WoLF PSORT在線軟件對該蛋白的亞細胞定位進行分析，結(jié)果表明，該蛋白位于葉綠體中的分值最高，故推斷，PAL蛋白可能存在于植物的葉綠體內(nèi)，并在葉綠體中行使功能。利用在線軟件TMHMM對蛋白序列跨膜區(qū)分析，結(jié)果顯示：預(yù)測的TMH數(shù)量為0，TMH中的AAs的Exp數(shù)為0.06378，小于18，為非膜蛋白。

2.4 磷酸化位點與信號肽分析

利用在線軟件NetPhos對該蛋白磷酸化位點進行分析。預(yù)測結(jié)果顯示：該蛋白具有38個磷酸化位點，其中絲氨酸有19個磷酸化位點，蘇氨酸有9個磷酸化位點，絡(luò)氨酸有10個磷酸化位點。利用在線軟件SignalP對該蛋白信號肽位點進行預(yù)測。信號肽分值低于0.5，不存在信號肽，為非分泌蛋白。

2.5 核定位分析

利用在線軟件NetNES進行核定位分析。結(jié)果顯示：第66位氨基酸為賴氨酸，其NES評分為0.686，超過閾值， 預(yù)計該賴氨酸殘基會參與核出口信號。

2.6 高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用在線軟件HNN及CPHmodels分析蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：該蛋白由大量α-螺旋、無規(guī)卷曲及少量延展鏈構(gòu)成，其中，346個氨基酸參與形成α-螺旋，占氨基酸總數(shù)的47.92%；333個氨基酸參與形成無規(guī)卷曲，含量為46.12%；43個氨基酸參與形成延展鏈，含量為5.96%（見圖2）。

2.7 氨基酸同源進化樹的構(gòu)建

將PAL蛋白與其同源的21條氨基酸序列構(gòu)建同源進化樹（見圖3）。結(jié)果表明：該蛋白與馬鈴薯其他同類基因的進化關(guān)系更近，與辣椒的同類基因的進化關(guān)系較為相近。因此推斷該蛋白屬于馬鈴薯PAL家族，并由此推測其可能同馬鈴薯PAL具有類似的活性和功能。

3 結(jié)論與討論

本文運用多種生物信息學(xué)方法進行分析，結(jié)果顯示：馬鈴薯PAL基因全長2529個堿基對，編碼722個氨基酸，分子量為78.5kDa，理論等電點為6.03。此蛋白是脂溶性、親水性的穩(wěn)定蛋白，無結(jié)構(gòu)功能域，無信號肽，無膜穿透性，共有38個磷酸化位點。通過對其高級結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)有三種結(jié)構(gòu)形式，分別為α-螺旋，無規(guī)卷曲和延展鏈，這為一些功能的實現(xiàn)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

PAL酶的穩(wěn)定性和積累量直接影響植株的抗逆能力[10]。黃小貞等報告了在PAL基因表達量高的條件下，相應(yīng)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量隨之升高，植株整體抗逆能力增強[4]。從這些同類研究中我們可以推論，對PAL基因的生物信息學(xué)分析及后續(xù)的基因功能研究將對其在馬鈴薯相關(guān)的抗病育種實踐方面具有重要意義。本文僅為今后PAL在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用提供基本的理論基礎(chǔ)，希望能夠?qū)ζ浜罄m(xù)功能研究起到一定作用。

參考文獻：

[1] 高雪.植物苯丙氨酸解氨酶研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2009，（01）：30-33.

[2] Shaw NM， Bolwell GP， Smith C. Wound-induced phenylala- nine ammonia-lyase in potato （Solanum tuberosum） tuber discs. Significance of glycosylation and immunolocalization of enzyme subunits[J].Biochemical Journal. 1990，267，（1）：163-170.

[3] Xuebin Zhang， Chang-Jun Liu. Multifaceted regulations of gateway enzyme phenylalanine mmonia-lyase in the biosyn thesis of phenylpropanoids[J]. Molecular Plant， 2015，8，（1）：17-27.

[4] 黃小貞，趙德剛.植物苯丙氨酸解氨酶表達調(diào)控機理的研 究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45，（04）：16-20.

[5] 吳瓊，方吳云，王文杰.機械損傷誘導(dǎo)植物苯丙氨酸解氨酶 活性研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016，（01）：157-158.

[6] 張治飛.青枯菌的基因標(biāo)記及馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)信號 途徑探究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[7] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所.土豆主食產(chǎn)品將改變中國 人餐桌[J].農(nóng)產(chǎn)品市場周刊，2015，（21）：47.

[8] 黃勇. 馬鈴薯青枯病抗性資源的鑒定及效應(yīng)蛋白突變體 的篩選[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué). 2016.

[9] 段江燕，安建梅，郜剛.感染青枯病馬鈴薯中幾種酶及蛋白 質(zhì)含量變化的研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2008，（01）：21-25.

[10] Chang A， Lim M-H， Lee S-W， Robb EJ， Nazar RN. tomato phenylalanine ammonia-lyase gene family， highly redundant but strongly underutilized[J]. The Journal of Biological Chem- istry. 2008，283， （48）：33591-33601.