郭寶貝，張東霞，劉 麗，鄭永惠 ，郭成俊 ，雷紅嬰 ，吳 政 ，郭 媛

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省植物保護(hù)植物檢疫總站，山西太原030006；3.山西省晉中種蜂場，山西晉中030600；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031）

蘋果作為落葉果樹中的重要樹種，也是享譽(yù)世界的4大水果之一，其栽培面積和分布范圍都居前列，產(chǎn)量效益可觀，在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)了重要位置。蘋果作為異花授粉植物，花粉直感現(xiàn)象在許多果實(shí)性狀上表現(xiàn)明顯，因此，授粉效果是果實(shí)品質(zhì)的重要影響因素[1]。利用蜜蜂為經(jīng)濟(jì)作物增產(chǎn)已經(jīng)為人所熟知[2]，對(duì)蜜蜂授粉增產(chǎn)機(jī)制的研究主要集中在植物授粉以前的各種優(yōu)勢條件上[3]，如授粉時(shí)間最佳、授粉充分、異源花粉授粉優(yōu)勢、充分利用有效花等等[4-5]，然而蜜蜂授粉后對(duì)植物花部生理發(fā)育的影響卻鮮有研究。

本研究通過幾種授粉方式對(duì)蘋果授粉后花部生理發(fā)育的比較，探討蜜蜂授粉的優(yōu)勢，旨在為更好地認(rèn)識(shí)蜜蜂授粉提供新材料。

1 材料和方法

1.1 材料

選取榆次豆腐莊7年生紅富士蘋果樹12株，15 cm×18 cm白蠟紙袋700個(gè)；人工授粉粉源采自運(yùn)城市臨猗縣張家坡村秦冠和嘎啦混合花粉。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2016年5月1日至6月18日在榆次豆腐莊選取試驗(yàn)樣地，共設(shè)置自然授粉（N）、蜜蜂授粉（B）、自花授粉（S）和人工授粉（D）4個(gè)試驗(yàn)組。每組選取樹齡、樹勢、花量一致的紅富士3株。

N組授粉方式為自然授粉；S組在5月1日開始選取氣球期花序300個(gè)套袋，并在5月3日花盛開當(dāng)天進(jìn)行人工自花授粉，此時(shí)授粉效果最佳[6]。D組也在5月1日選取氣球期花序300個(gè)套袋，5月3日采用4月7日在臨猗張家坡采集保存的秦冠和嘎啦混合花粉進(jìn)行人工授粉，花粉保存方法采用王欽麗等[7-8]的方法。授粉時(shí)每個(gè)花序去除中心花，保留邊緣花2朵，花粉用1.5 mL EP管盛裝花粉，用鉛筆橡皮頭適量蘸取花粉，在當(dāng)天已開花的柱頭上點(diǎn)授花粉，授粉后再將袋子套好[9-10]。B組采用蜜蜂授粉，需要套網(wǎng)，網(wǎng)內(nèi)設(shè)置1株紅星和3株紅富士，選取考察枝，考察枝上保留氣球期的花，其他花全部摘除，于5月2日下午將一箱蜂放入，5月3日進(jìn)行全天授粉，晚上將蜂箱搬離試驗(yàn)棚。

1.3 采樣及處理方法

1.3.1 花粉萌發(fā)和花粉管生長熒光觀察試驗(yàn) 對(duì)蜜蜂授粉、人工授粉和自然授粉3個(gè)組的花柱分別在 12，24，36，48，72，96 h 進(jìn)行取樣，每組每次處理重復(fù)不少于20根，然后放入FAA固定液中保存。由于自花授粉組全部敗育，所以未取得花粉管材料。1.3.2 胚、胚乳生長發(fā)育情況切片試驗(yàn) 共取樣16次，在5月3日授粉后2，4，6，10 h各取樣4次，5月 4，5，6日每天 9：00和 16：00各取樣 1次。5月15，19，25日，6 月 1，8，18 日每天 16：00取樣 1 次。取樣時(shí)間經(jīng)歷47d。所取樣本保存在FAA固定液中。

1.4 指標(biāo)測定及方法

花粉萌發(fā)、花粉管生長熒光觀察試驗(yàn)參照KHO的方法[11]，并在軟化時(shí)間上做適當(dāng)修改，確定為1 mol/L NaOH 40℃處理6 h，苯胺藍(lán)染色過夜。染色后用Olympus BX51顯微鏡熒光顯微系統(tǒng)觀察，并用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，每個(gè)處理重復(fù)不少于20根花柱。

胚、胚乳授粉后生長情況對(duì)比采用常規(guī)石蠟切片法，取樣后立即放入FAA中保存，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)。用Olympus BX51顯微鏡放大100倍觀察，并用Olympus E620數(shù)碼照相機(jī)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)、花粉管生長情況熒光觀察

考察所有時(shí)段的采集樣品，進(jìn)行花粉柱頭萌發(fā)及花粉管生長熒光觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)。蘋果柱頭花粉萌發(fā)和花粉管生長表示方法：花粉柱頭萌發(fā)情況，0為沒有花粉在柱頭萌發(fā)，1為柱頭有弱熒光，2為柱頭有強(qiáng)熒光，3為柱頭有超強(qiáng)熒光；花粉管生長情況，0為沒有花粉在柱頭萌發(fā)，1為柱頭觀察到花粉管熒光，2為花柱中部觀察到熒光，3為花柱根部觀察到熒光。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)列于表1，花粉柱頭萌發(fā)情況和花粉管生長情況如圖1所示。

表1 花粉管生長與柱頭花粉萌發(fā)熒光觀察情況統(tǒng)計(jì) 個(gè)

方差分析顯示，在P＜0.01水平上，B組柱頭花粉萌發(fā)情況與D，N組間差異極顯著；B，D組花粉管生長情況與N組間差異也極顯著（表2）。

花粉管生長對(duì)比試驗(yàn)中，B組、D組間不存在顯著差異。說明利用蜜蜂授粉完全可以達(dá)到人工授粉的效果[12]；柱頭花粉萌發(fā)對(duì)比中，B組與N，D組間存在極顯著差異，并在柱頭花粉萌發(fā)強(qiáng)度上具有絕對(duì)優(yōu)勢。B組在柱頭超強(qiáng)熒光的數(shù)量上占考察柱頭總數(shù)的29.66%，而D，N組僅為6.20%和2.88%。3種授粉方式中，蜜蜂在傳粉效果上具有絕對(duì)優(yōu)勢。

考察花粉管生長情況，花粉管生長到花柱中部的數(shù)量占總考察花柱數(shù)的比例，D組為35.66%，B組為48.97%；花粉管生長到花柱根部的數(shù)量占總考察花柱數(shù)的比例，D組為5.43%，B組為1.38%。

表2 蘋果柱頭花粉萌發(fā)和花粉管生長熒光觀察結(jié)果（P＜0.01，S-N-K方差分析） 個(gè)

2.2 胚、胚乳生長情況觀察

2，4，6，10，24 h 切片顯示，橢圓形胚囊保持完整（圖 2-1，2），N，B，S，D 組之間沒有明顯的差別。受精后48 h珠心細(xì)胞開始解體，為胚囊發(fā)育提供營養(yǎng)，D組珠心解體程度比其他3組大（圖2-3，4）。72 h切片結(jié)果同48 h，D組珠心裂解程度較大。

13 d取樣切片顯示，D組水樣狀的胚乳正在逐漸消失，胚的發(fā)育正在進(jìn)入加速階段，要比其他3組發(fā)育的快（圖2-5，6）。在第17天時(shí)，B，D組胚珠的正中間可以看到受精合子，體積擴(kuò)大，侵蝕四周的珠心細(xì)胞，N組中沒有觀察到（圖2-7，8，9）。從13 d起，S組由于受精情況不好，花部逐漸凋零，S組不再取樣。

從5月25日即授粉后23 d的切片中看到，B組受精卵開始發(fā)育，N組中棒狀胚已經(jīng)形成，D組也看到了受精卵，（圖2-10，11）。30 d取樣切片觀察可以看到，B組已經(jīng)形成非常典型的心形胚（圖2-12）。而在D組，魚雷胚的雛形已經(jīng)形成（圖2-13），但在N組所做的切片中，只看到了典型的球狀胚（圖2-14）。37 d切片觀察，D組已經(jīng)形成比較完備的子葉型胚（圖2-16），在B組及N組，子葉型胚的發(fā)育沒有D組完備（圖2-15，17）。授粉后47 d時(shí)，D組和B組已經(jīng)看到成熟胚的胚乳（圖2-18，19）。N組中沒有觀察到這一現(xiàn)象（圖2-20）。

3 討論

3.1 熒光觀察試驗(yàn)

花粉管熒光觀察試驗(yàn)表明，在花粉管抑制物開始作用以前，蜜蜂授粉促進(jìn)花粉管生長情況好于人工授粉組，隨著花粉管的進(jìn)一步生長，高異質(zhì)性花粉生長優(yōu)勢明顯，達(dá)到花柱根部的花粉管數(shù)量要多于花粉異質(zhì)性低的蜜蜂授粉組。結(jié)合授粉時(shí)柱頭花粉數(shù)量情況，可以推斷D組花粉管到達(dá)花柱根部的數(shù)量比B組多的原因是由花粉異質(zhì)性差別引起的。另外，花粉萌發(fā)及花粉管生長具有群體效應(yīng)，D組點(diǎn)授的方式使得大量花粉落到柱頭上，也是花粉管長到根部數(shù)量較多的原因之一[13]。將蜜蜂授粉應(yīng)用于大田授粉后，隨著蜜蜂采集花粉異質(zhì)性的提高，授粉效果就會(huì)得到改善[14]。這一點(diǎn)在自花授粉組也得到驗(yàn)證，S組由于自交不親和性導(dǎo)致自花授粉的花在授粉第13天后全部凋落，原因是自花授粉花柱內(nèi)自交不親和性基因（S基因）所表達(dá)的S-RNase，降解了自花花粉管RNA而抑制了花粉管生長[15]，自花授粉的花粉管在花柱內(nèi)無法生長，花粉管不能進(jìn)入胚囊，受精無法完成，致自花授粉不結(jié)果。

D組異源花粉強(qiáng)親和性使花粉管生長到達(dá)花柱根部的數(shù)量較多。B組蜜蜂的授粉時(shí)間為1 d，但在花粉柱頭萌發(fā)數(shù)量、花粉管未受抑制前花粉管的生長上占絕對(duì)優(yōu)勢，由于蜜蜂授粉組試驗(yàn)授粉樹配置的制約，花粉異質(zhì)性不足使得大部分生長至花柱中部的花粉管受到抑制，不能到達(dá)花柱根部，如果將蜜蜂授粉應(yīng)用于大田或設(shè)施作物授粉，隨著采集花粉異質(zhì)性的提高，這一問題就會(huì)得到解決，授粉效果會(huì)得到提高[16-17]。綜合花粉管生長、花粉柱頭萌發(fā)2個(gè)試驗(yàn)，蜜蜂授粉組表現(xiàn)出柱頭花粉萌發(fā)數(shù)量多，花粉管生長較人工授粉組好，蜜蜂授粉效果完全可以取代人工授粉，特別是在授粉樹配置合理情況下，授粉效果會(huì)得到有效提升[18]。

3.2 胚、胚乳切片試驗(yàn)

蘋果是雙受精植物，受精過程中一個(gè)生殖核與卵細(xì)胞結(jié)合，發(fā)育成受精胚；另一個(gè)生殖核則與2個(gè)助細(xì)胞結(jié)合，發(fā)育成為半透明狀的胚乳，作為幼胚發(fā)育時(shí)的養(yǎng)分，隨著子葉的生長而逐漸消失。蘋果胚珠類型是直立胚珠，胚狀體不同發(fā)育時(shí)期在形態(tài)學(xué)上經(jīng)歷原胚、球狀胚、心形胚、子葉型胚和成熟胚等不同發(fā)育階段。

切片較好反映了胚、胚乳的發(fā)育過程，對(duì)蜜蜂授粉組、人工授粉組、自然授粉及自花授粉的比較得出，授粉后 2，4，6，10，24 h 切片，橢圓形胚囊保持完整，各個(gè)組之間的發(fā)育差別不明顯。授粉后48，72 h時(shí)，珠心細(xì)胞解體，D組的解體程度明顯大于B組和N組，在S組中沒有觀察到解體。授粉后13 d，D組水樣狀的胚乳在消失的程度上大于其他2組，說明發(fā)育快于其他2組。S組的子房沒有得到受精后生長發(fā)育的刺激，花部大部分掉落[19]。

17 d的切片觀察到B，D組的受精合子，沒有在N組中看到這一現(xiàn)象，說明N組發(fā)育滯后。授粉后23 d N組觀察到了棒狀胚，B組和D組受精卵開始分裂成小球，此時(shí)N組發(fā)育較快，是由于被觀察到的這個(gè)樣本授粉較早所致。B，D，N組之間差別最大的是在授粉后30 d，D組已經(jīng)形成了典型的心形胚，而B組心形胚的發(fā)育才剛開始，N組只觀察到球形胚。37 d切片觀察，D組發(fā)育成子葉型胚，B，N組發(fā)育沒有D組完備。47 d時(shí)B組和D組已經(jīng)看到成熟胚，N組只觀察到子葉型胚。

B組在胚、胚乳發(fā)育速度上相對(duì)D組較慢，這是異源花粉強(qiáng)親和性導(dǎo)致的結(jié)果，對(duì)比N組的自然授粉，B組還是具有明顯的優(yōu)勢，說明蜜蜂授粉的花粉親和性比自然授粉組的要強(qiáng)。在23 d時(shí)N組的胚發(fā)育明顯快于D組和B組，原因是自然授粉中也存在授粉效果較好的現(xiàn)象，但在其他時(shí)間段內(nèi)，N組發(fā)育要比其他2組明顯落后。

4 結(jié)論

采用蜜蜂授粉，保證了充足的柱頭花粉萌發(fā)數(shù)量，花粉管生長，胚、胚乳能充分、快速發(fā)育，并結(jié)合蜜蜂授粉成本低，無農(nóng)藥、激素污染等優(yōu)勢，是蘋果無公害生產(chǎn)必須的技術(shù)措施之一，使其完全可取代人工授粉[20-21]。另外，蜜蜂授粉在胚、胚乳發(fā)育速度上存在的優(yōu)勢，證明蜜蜂授粉對(duì)花部生長發(fā)育起到了促進(jìn)作用，其中深層次的原因有待進(jìn)一步研究。