劉荷英 程奇珍 周敏 易巧

摘 要 目的：建立測(cè)定馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液中有關(guān)物質(zhì)的方法，并對(duì)其雜質(zhì)進(jìn)行定性。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的含量，色譜柱為ACES C18，流動(dòng)相為甲醇與4.32 g/L辛烷磺酸鈉溶液（冰醋酸調(diào)pH至3.0）的混合溶液（50 ∶ 50，V/V）-甲醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為295 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。采用制備液相色譜法制備雜質(zhì)純品，色譜柱為YMC-PACK ODS-A，流動(dòng)相為甲醇-0.01%三氟乙酸（40 ∶ 60，V/V）和甲醇-0.01%三氟乙酸（20 ∶ 80，V/V），流速為8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為295 nm，柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為0.8 mL。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18，流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.05%甲酸）（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；采用電噴霧離子源，以質(zhì)譜全掃描模式檢測(cè)母離子，以子離子掃描模式檢測(cè)碎片離子。采用氫譜、碳譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和推測(cè)。結(jié)果：馬來(lái)酸噻嗎洛爾檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.501～10.02 μg/mL（r=0.999 9）；定量限為3.012 ng，檢出限為1.004 ng；精密度試驗(yàn)的RSD為0.2%，穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于5%。確證了雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)，并推測(cè)了雜質(zhì)Ⅳ和Ⅴ的結(jié)構(gòu)。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 馬來(lái)酸噻嗎洛爾；有關(guān)物質(zhì)；降解雜質(zhì)；高效液相色譜法；制備液相色譜；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；氫譜；碳譜；測(cè)定；結(jié)構(gòu)推測(cè)

中圖分類號(hào) R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）16-2208-07

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of related substances in Timolol maleate eye drops， and to conduct qualitative analysis of its degradation impurities. METHODS： HPLC method was adopted for determination of related substance. The determination was performed on ACES C18 column with mobile phase consisted of the mixed solution of methanol and 4.32 g/L sodium octane sulfonate （pH adjusted to 3.0 with glacial acetic acid）（50 ∶ 50，V/V）-methanol （gradient elution） at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 295 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. Preparative LC method was used to prepare pure impurities. The determination was performed on YMC-PACK ODS-A column with mobile phase consisted of methanol-0.01% trifluoroacetic acid （40 ∶ 60，V/V） and methanol-0.01% trifluoroacetic acid （20 ∶ 80，V/V） at flow rate of 8 mL/min. The detection wavelength was set at 295 nm， and column temperature was 20 ℃. The sample size was 0.8 mL. LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of methanol-5 mmol/L ammonium formate （0.05% formic acid） （gradient elution） at flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was 20 ℃. The sample size was 2 μL. The electrospray ionization source was conducted， detecting patient ion by MS full scan and fragment ion by daughter ion scan. The structure was confirmed and speculated by 1H-NMR and 13C-NMR. RESULTS： The linear range of timolol maleate was 0.501-10.02 μg/mL （r=0.999 9）. The limit of quantitation was 3.012 ng， and the limit of detection was 1.004 ng. RSD of precision test was 0.2%. RSDs of stability and reproducibility tests were all lower than 5%. The structures of impurityⅠ， Ⅱ and Ⅲ were confirmed， and those of impurity Ⅳ and Ⅴ were speculated. CONCLUSIONS： The method is rapid， accurate and specific. It can be used for the determination of related substance in Timolol maleate eye drops.

KEYWORDS Timolol maleate； Related substance； Degradation impurity； HPLC； Preparative LC； LC-MS/MS； 1H-NMR； 13C-NMR； Determination； Structure speculation

馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液是治療原發(fā)性開(kāi)角型青光眼及無(wú)晶狀體眼性青光眼的藥物。該滴眼液及其原料藥的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均收載于2015年版《中國(guó)藥典》（二部）[1]，滴眼液標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，原料藥標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法控制有關(guān)物質(zhì)，而該方法靈敏度和專屬性均較差。2017年版《英國(guó)藥典》[2]中馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液及其原料藥標(biāo)準(zhǔn)均設(shè)置了有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，以高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定雜質(zhì)B、C、D、E、F和其他雜質(zhì)，并收載了雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I、J的結(jié)構(gòu)。《美國(guó)藥典》（40版）[3]中僅對(duì)馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置了有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，也以HPLC法測(cè)定雜質(zhì)B、C、D、E、F和其他雜質(zhì)，但色譜條件與2017年版《英國(guó)藥典》[2]不同?！度毡舅幍洹罚?7版）[4]中僅收載了馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC法，以主成分自身對(duì)照法計(jì)算單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)的含量?！稓W洲藥典》（9.0版）[5] 中僅收載了馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥標(biāo)準(zhǔn)，其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法與2017年版《英國(guó)藥典》[2]完全一致。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)[6-10]報(bào)道的馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液或原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法均為HPLC法。有研究將系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中通過(guò)堿破壞后的樣品與《歐洲藥典》（9.0版）[5]對(duì)比以確定雜質(zhì)B、D、G[6]；另有研究采用HPLC法測(cè)定了馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液中主成分和3個(gè)可能的降解雜質(zhì)（其結(jié)構(gòu)與雜質(zhì)B、D、G結(jié)構(gòu)一致）[10]。此外，未見(jiàn)其他有關(guān)馬來(lái)酸噻嗎洛爾降解雜質(zhì)的報(bào)道。有研究認(rèn)為，馬來(lái)酸噻嗎洛爾進(jìn)入人體后，噻嗎洛爾嗎啉環(huán)上的碳原子首先被羥化，而后進(jìn)一步代謝為噻嗎洛爾乙醇胺[11]。目前，國(guó)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液中添加的抑菌劑有4種，分別為羥苯乙酯、苯扎溴銨、硫柳汞和醋酸苯汞[12]，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)需排除抑菌劑的色譜峰干擾。本課題組參考2017年版《英國(guó)藥典》[2]馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的色譜條件，建立了馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，同時(shí)通過(guò)強(qiáng)制降解試驗(yàn)考察了馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液中的主要降解雜質(zhì)，并以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）對(duì)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證或推測(cè)，旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括U3000四元泵、U3000柱溫箱、U3000二極管陣列檢測(cè)器（DAD）等（美國(guó)戴安公司）； LC-6AD型LC儀，包括LC-6AD二元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A DAD、FRC-10A餾分收集器（日本島津公司）；Xevo TQ-S型液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，包括Acquity UPLC自動(dòng)進(jìn)樣器、Acquity UPLC 四元泵、Acquity UPLC 柱溫箱、Acquity UPLC DAD（美國(guó)沃特世公司）；Bruker 600 MHz核磁共振譜儀（德國(guó)布魯克公司）；MS105型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液[武漢五景藥業(yè)有限公司，批號(hào)：16050101、16040105、16040106，規(guī)格：5 mL ∶ 25 mg（按噻嗎洛爾計(jì)）]；馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150207，純度：>99%）；噻嗎洛爾系統(tǒng)適用性對(duì)照品（《歐洲藥典》（9.0版），歐洲藥品質(zhì)量管理局，ID：001EI2，規(guī)格：5 mg/支，含馬來(lái)酸噻嗎洛爾和雜質(zhì)B、C、D、F的混合物）；辛烷磺酸鈉（離子對(duì)色譜用試劑，北京百靈威科技有限公司）；甲醇、甲酸、三氟乙酸、甲酸銨均為色譜純，冰醋酸等其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的HPLC色譜條件

色譜柱：ACES C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇與4.32 g/L辛烷磺酸鈉溶液（冰醋酸調(diào)pH至3.0）的混合溶液（50 ∶ 50，V/V）（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～14 min，97.5% A；14～15.5 min，97.5% A→70% A；15.5～25 min，70% A；25～25.5 min，70% A→97.5% A；25.5～32 min，97.5% A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：295 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 制備雜質(zhì)純品的LC色譜條件

色譜柱：YMC-PACK ODS-A（250 mm×20 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.01%三氟乙酸溶液（40 ∶ 60，V/V）（流動(dòng)相①）和甲醇-0.01%三氟乙酸溶液（20 ∶ 80，V/V）（流動(dòng)相②）；流速：8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：295 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：0.8 mL。

2.3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)的LC-MS/MS條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.05%甲酸）（B），梯度洗脫（0～5 min，20% A→35% A；5～8 min，35% A→60% A；8～8.1 min，60% A→20% A；8.1～11 min，20% A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）/大氣壓化學(xué)離子源（APCI），正離子化（ESI+）；去溶劑溫度：400 ℃；干燥氣流量：8 L/h；毛細(xì)管電壓：1.5 kV；錐孔電壓：40 V；母離子掃描模式：質(zhì)譜全掃描模式檢測(cè)母離子，掃描范圍：m/z 100～1 000；碰撞能量：30 V；子離子掃描模式：子離子掃描模式檢測(cè)碎片離子，掃描范圍根據(jù)母離子質(zhì)荷比而定。

2.4 溶液的制備

2.4.1 供試品溶液 精密量取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品適量，加水稀釋制成每1 mL中含馬來(lái)酸噻嗎洛爾2.5 mg的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 自身對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 空白輔料溶液 按馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼的制備工藝制備不含馬來(lái)酸噻嗎洛爾的陰性樣品，取適量按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備空白輔料溶液。

2.4.4 系統(tǒng)適用性溶液 取噻嗎洛爾系統(tǒng)適用性對(duì)照品1支，精密加入“2.1”項(xiàng)下流動(dòng)相（A）2 mL溶解，搖勻，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別量取“2.4”項(xiàng)下供試品溶液、自身對(duì)照溶液、空白輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，雜質(zhì)峰之間、主成分與雜質(zhì)峰之間均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，空白輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.6 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

2.6.1 堿破壞 精密量取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品和陰性樣品各5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，置于100 ℃水浴上加熱1 h，放冷后加2 mol/L鹽酸溶液2 mL中和，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖2A、圖2B。

2.6.2 氧化破壞 精密量取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品和陰性樣品各5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加30%過(guò)氧化氫溶液2 mL，室溫放置1 h，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖2C、圖2D。

2.6.3 酸破壞 精密量取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品和陰性樣品各5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加2 mol/L鹽酸溶液2 mL，置于100 ℃水浴上加熱1 h，放冷后加2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL中和，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖2E、圖2F。

2.6.4 光照破壞 精密量取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品和陰性樣品各5 mL，分別置于10 mL量瓶中，于4 500 lx紫外燈下照射24 h，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖2G、圖2H。

2.6.5 高溫破壞 精密量取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品和陰性樣品各5 mL，分別置于10 mL量瓶中，置于100 ℃水浴上加熱1 h，放冷后加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖2I、圖2J。

由圖2可知，馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品在堿破壞條件下可降解出雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ，相對(duì)于噻嗎洛爾峰的保留時(shí)間分別為0.24和0.63；在氧化破壞條件下降解出雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ，相對(duì)于噻嗎洛爾峰的保留時(shí)間分別為0.11和0.32；在酸破壞條件下主要降解出雜質(zhì)Ⅴ，相對(duì)于噻嗎洛爾峰的保留時(shí)間為0.50；在光照和高溫破壞條件下均降解出雜質(zhì)Ⅱ和雜質(zhì)Ⅲ。陰性樣品經(jīng)上述破壞后均發(fā)生降解，但其降解產(chǎn)物的色譜峰不干擾雜質(zhì)Ⅰ～Ⅴ的測(cè)定。

2.7 線性關(guān)系考察

精密稱取馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥10.02 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為0.501、1.002、2.505、5.010、10.02 μg/mL的線性關(guān)系考察系列溶液。精密量取上述線性關(guān)系考察系列溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以馬來(lái)酸噻嗎洛爾質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.388x-0.002（r=0.999 9）。結(jié)果表明，馬來(lái)酸噻嗎洛爾檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.501～10.02 μg/mL。

2.8 定量限與檢出限考察

精密稱取馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥25.10 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取3、1 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得馬來(lái)酸噻嗎洛爾質(zhì)量濃度分別為150.60、50.20 ng/mL的溶液。分別量取上述溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算定量限（信噪比為10 ∶ 1）、檢出限（信噪比為3 ∶ 1）。結(jié)果，馬來(lái)酸噻嗎洛爾的定量限為3.012 ng，檢出限為1.004 ng。

2.9 精密度試驗(yàn)

取“2.4.2”項(xiàng)下自身對(duì)照溶液（批號(hào)：16050101）20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，馬來(lái)酸噻嗎洛爾峰面積的RSD為0.2%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：16050101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ、其他雜質(zhì)1、其他雜質(zhì)2峰面積的RSD分別為2.8%、2.1%、3.6%、2.9%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn)

取馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品（批號(hào)：16050101）適量，按“2.4.1”和“2.4.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液和對(duì)照溶液，各6份，分別精密量取兩種溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算樣品中各雜質(zhì)的含量。結(jié)果，雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ、其他雜質(zhì)1、其他雜質(zhì)2的平均含量分別為0.02%、0.05%、0.01%、0.03%，峰面積的RSD分別為3.4%、3.0%、4.8%、3.8%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.12 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取3批馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品各適量，按“2.4.1”和“2.4.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液和對(duì)照溶液，各3份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算樣品中各雜質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.13 雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)確證

取馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥0.1 g，置于10 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，置于100 ℃水浴上加熱6 h，放冷后加1 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，得濾液①（續(xù)濾液）。量取濾液①0.8 mL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采用流動(dòng)相①進(jìn)行分離，分別收集雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ的流出液。取馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥0.1 g，置于10 mL量瓶中，加30%過(guò)氧化氫溶液1 mL，室溫放置4 h，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，得濾液②（續(xù)濾液）。量取濾液② 0.8 mL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采用流動(dòng)相②進(jìn)行分離，收集雜質(zhì)Ⅲ的流出液。將雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的流出液分別于40 ℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)由倭克畯?fù)溶，凍干，得雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的純品。采用 LC-MS/MS法對(duì)雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推測(cè)（分別取雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的純品適量，加水溶解，制成雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得質(zhì)譜掃描的母離子和子離子信息），并采用1H-NMR和13C-NMR對(duì)雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證（溶劑為氘代二甲基亞砜），結(jié)果見(jiàn)表2。

2.14 雜質(zhì)Ⅳ的結(jié)構(gòu)推測(cè)

筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)Ⅳ不穩(wěn)定，在制備純品過(guò)程中極易發(fā)生降解，很難制備其純品，因此僅通過(guò)LC-MS/MS法進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)。精密量取“2.6.3”項(xiàng)下經(jīng)氧化破壞的馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析（為避免污染離子源，通過(guò)閥切換將0～1.2 min、2.8～4.6 min的樣品溶液切換到廢液，不進(jìn)MS儀），根據(jù)各色譜峰的DAD光譜圖判斷雜質(zhì)Ⅳ的峰位（色譜圖見(jiàn)圖3，總離子流圖見(jiàn)圖4）。雜質(zhì)Ⅳ在該LC-MS/MS條件下分裂為兩個(gè)峰，兩個(gè)峰的DAD光譜圖與一級(jí)質(zhì)譜以及二級(jí)質(zhì)譜圖完全相同（雜質(zhì)Ⅳ的DAD光譜圖見(jiàn)圖5，全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，子離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7），推測(cè)兩個(gè)峰為旋光異構(gòu)體。由圖6、圖7可知，雜質(zhì)Ⅳ的母離子為m/z 333.4，推測(cè)為[M+H]+峰；子離子分別為m/z 260.1、214.2、173.2、161.1、130.2、117.1、112.1、74.0，推測(cè)雜質(zhì)Ⅳ為噻嗎洛爾噻唑環(huán)上的硫原子氧化產(chǎn)物，為l-（叔丁氨基）-3-[（4-嗎啉基-1，2，5-噻二唑-1-氧-3-基）氧]-2-丙醇。因其2位碳原子為手性原子，推測(cè)其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖8。

2.15 雜質(zhì)Ⅴ的結(jié)構(gòu)推測(cè)

由于雜質(zhì)Ⅴ含量較低，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)酸破壞條件進(jìn)行優(yōu)化后仍無(wú)法提高其含量，很難制備其純品，因此僅通過(guò)LC-MS/MS法進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)。同時(shí)，馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品經(jīng)酸破壞后，輔料羥苯乙酯峰與雜質(zhì)Ⅴ峰保留時(shí)間相近，為避免干擾，用原料藥進(jìn)行酸破壞后分析。稱取馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥約10 mg，置于10 mL量瓶中，加2 mol/L鹽酸溶液2 mL，置于100 ℃水浴上加熱1 h，放冷后加2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL中和，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果原料藥經(jīng)酸破壞后產(chǎn)生的主要雜質(zhì)峰與馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液樣品經(jīng)酸破壞后產(chǎn)生的主要雜質(zhì)峰的保留時(shí)間和DAD光譜圖一致，均為雜質(zhì)Ⅴ。再量取上述續(xù)濾液2 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析（為避免污染離子源，通過(guò)閥切換將0～1.5 min、4.0～9.0 min的樣品溶液切換到廢液，不進(jìn)MS儀），根據(jù)各色譜峰的DAD光譜圖判斷雜質(zhì)Ⅴ的峰位和推測(cè)結(jié)構(gòu)（色譜圖見(jiàn)圖9，總離子流圖見(jiàn)圖10，雜質(zhì)Ⅴ的DAD光譜圖見(jiàn)圖11，全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖12，子離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖13）。由圖12、圖13可知，雜質(zhì)Ⅴ的母離子為m/z 313.4，子離子分別為m/z 184.1、152.1、130.2、74.1，推測(cè)雜質(zhì)Ⅴ為噻嗎洛爾嗎啉環(huán)脫氫產(chǎn)物，可能為1-（叔丁基氨基）-3-{[4-（4H-1，4-噁嗪-4-基）-1，2，5-噻二唑-3-基]氧}-2-丙醇，推測(cè)其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖14。

3 討論

國(guó)外僅有1篇文獻(xiàn)報(bào)道了噻嗎洛爾的核磁數(shù)據(jù)[13]；雖然2017年版《英國(guó)藥典》[2]和《美國(guó)藥典》（40版）[3]中均收載了其多個(gè)已知雜質(zhì)，但均無(wú)噻嗎洛爾降解雜質(zhì)的核磁數(shù)據(jù)。本研究中，經(jīng)1H-NMR和13C-NMR確證，堿破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)Ⅰ和Ⅱ結(jié)構(gòu)分別與2017年版《英國(guó)藥典》[2]中的雜質(zhì)B和D一致，雜質(zhì)B化學(xué)名為3-[（1，1-二甲基乙基）氨基]-2-{[4-（嗎啉-4-基）-1，2，5-噻二唑-3-基]氧基}丙烷-1-醇，雜質(zhì)D化學(xué)名為4-（嗎啉-4-基）-1，2，5-噻二唑-3-醇；氧化破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)Ⅲ結(jié)構(gòu)與2017年版《英國(guó)藥典》[2]中的雜質(zhì)G一致，化學(xué)名為4-（嗎啉-4-基）-1，2，5-噻二唑-3（2H）-1-氧化物。

對(duì)于樣品中含量較低或不穩(wěn)定的雜質(zhì)，可采用LC-MS/MS法進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)，本研究即采用LC-MS/MS法推測(cè)了雜質(zhì)Ⅳ、Ⅴ的結(jié)構(gòu)。目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了LC-MS/MS法用于雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)[14-16]，但該法僅通過(guò)質(zhì)譜推測(cè)結(jié)果可能產(chǎn)生偏差。對(duì)于降解雜質(zhì)的定性研究，一般可通過(guò)強(qiáng)制降解試驗(yàn)來(lái)加速藥物降解，以提高降解雜質(zhì)的含量，藥物經(jīng)破壞后雜質(zhì)含量若能達(dá)到20%以上，則易通過(guò)制備LC法來(lái)分離和純化雜質(zhì)，得到雜質(zhì)純品后可經(jīng)核磁、紅外、紫外等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，準(zhǔn)確度較高。

馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液在氧化破壞、堿破壞、酸破壞條件下均可發(fā)生較明顯的降解，其中在氧化破壞和堿破壞條件下降解較快、降解率較高。馬來(lái)酸噻嗎洛爾氧化破壞時(shí)硫原子首先發(fā)生氧化破壞，生成雜質(zhì)Ⅳ，后醚鍵水解生成雜質(zhì)Ⅲ；堿破壞時(shí)易生成雜質(zhì)Ⅰ，后醚鍵水解生成雜質(zhì)Ⅱ；酸破壞時(shí)加熱后嗎啉環(huán)脫氫生成雜質(zhì)Ⅴ。其中，雜質(zhì)Ⅳ、Ⅴ均為未知雜質(zhì)，且均為首次報(bào)道。

綜上所述，本方法快速、準(zhǔn)確、專屬性好，可為馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2018-02-14 修回日期：2018-06-15）

（編輯：陳 宏）