陳朝 劉泰 黃一摯 黃敏 甘典輝 龔敏陽 黎紅丹

摘 要 目的：研究疏血通脈膠囊對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)保護作用。方法：將36只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、尼莫地平組（0.01 g/kg）和疏血通脈膠囊低、中、高劑量組（0.32、0.64、1.28 g/kg），每組6只。除假手術(shù)組外，其余5組大鼠均以線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型，造模成功后灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)28 d。于給藥前及給藥后3、7、14、28 d采用改良神經(jīng)功能評分法進行大鼠神經(jīng)功能缺損評分；給藥后28 d以三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，以免疫組化法檢測大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達情況。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高，腦組織皮質(zhì)區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著增加，BDNF表達顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組和疏血通脈膠囊低、中、高劑量組大鼠給藥后7、14、28 d神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低；給藥后28 d腦組織皮質(zhì)區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少，BDNF表達顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：舒血通脈膠囊對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)功能有一定保護作用，其機制可能與增強BDNF表達，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 疏血通脈膠囊；腦缺血再灌注；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；細(xì)胞凋亡

中圖分類號 R743；R285 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2184-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the neuroprotective effect of Shuxue tongmai （SXTM） capsules on cerebral ischemia- reperfusion injury model rats. METHODS： A total of 36 SD rats were randomly divided into sham operation group （equal volume 0.9% sodium chloride solution）， model group （equal volume 0.9% sodium chloride solution）， nimodipine group （0.01 g/kg）， SXTM capsules low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.32， 0.64， 1.28 g/kg）， with 6 rats in each group. Except for sham operation group， cerebral ischemia reperfusion injury model of rats was established in other 5 groups， and relevant medicine was given intragastrically after modeling，once 2 day， for consecutive 28 d. Neurological function deficit scores were by mNSS method obtained before medication and 3， 7， 14， and 28 d after medication. The cortical neuron apoptosis in cortexarea of rats braintissue was determined by TUNEL method 28 d after medication. The expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in cerebral tissue was determined by immunohistochemical staining mothed. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurological function deficit score of model group was increased significantly 7， 14， 28 d after medication. The number of apoptotic cell was increased significantly 28 d after medication， and the expression of BDNF was strengthened significantly，there were significient difference （P<0.01）. Compared with model group， neurological function scores of nimodipine group and SXTM capsules low-dose， medium-dose and high-dose groups were decreased significantly （P<0.01）. The number of apoptotic cell was decreased significantly 28 d after medication （P<0.01）， and the expression of BDNF was strengthened significantly， there were significient difference （P<0.01）. CONCLUSIONS： SXTM capsules has a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting neuronal apoptosis and strengthening the expression of BDNF.

KEYWORDS Shuxue tongmai capsules； Cerebral ischemia-reperfusion； Brain-derived neurotrophic factor； Cell apoptosis

缺血性腦中風(fēng)是因大腦血液供應(yīng)受到干擾所造成的腦功能迅速喪失的一種疾病，是造成人類嚴(yán)重殘疾和死亡的重要原因之一。腦缺血再灌注的危害極大，其間會產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，從而啟動一系列機制導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡和壞死[1-2]。疏血通脈膠囊是基于廣西名中醫(yī)劉泰教授經(jīng)驗中藥方劑經(jīng)現(xiàn)代工藝程序所制得的膠囊制劑（專利號：2013104694924）[3-4]，該藥由三七、薤白、地龍、瓜蔞皮、冰片等藥材組合而成，具有化痰熄風(fēng)、祛瘀通絡(luò)、痰瘀同治之功，主要用于缺血性腦中風(fēng)的治療。前期實驗發(fā)現(xiàn)，該藥可防治血栓的形成及發(fā)展，減輕缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)，改善腦循環(huán)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5-6]。但其對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用機制尚不明確。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員，由腦組織合成，并廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元及多巴胺神經(jīng)元提供強大的營養(yǎng)支持，在神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和結(jié)構(gòu)重建過程中起重要作用[7-8]。

本研究擬給予大腦中動脈閉塞所致的腦缺血再灌注損傷模型大鼠疏血通脈膠囊進行干預(yù)，觀察其對模型大鼠神經(jīng)功能的保護作用，及對模型大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和BDNF表達的影響，以期進一步揭示其作用機制，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

IX53型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；EG1150H型生物組織包埋機、ASP200S型組織脫水機、RM2245型石蠟切片機（德國Leica公司）；Image-Pro Plus V6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 藥品與試劑

疏血通脈膠囊（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室自制，批號：20160304，規(guī)格：0.5 g/粒）；尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H40000119，批號：1411048，規(guī)格：20 mg/片）；兔抗大鼠BDNF抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA20140601）；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）試劑盒（批號：16151A06，包括二抗、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（批號：K1552317E）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（河北博海生物開發(fā)工程有限公司，批號：161705）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級健康SD大鼠36只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（桂）2014-0002。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，自由進食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將36只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、尼莫地平組（0.01 g/kg）和疏血通脈膠囊低、中、高劑量組（0.32、0.64、1.28 g/kg），每組6只。給藥依據(jù)：尼莫地平片成人每日劑量為0.1 g/60 kg，根據(jù)大鼠藥物劑量換算關(guān)系表[9]，計算得大鼠的等效劑量為0.01 g/kg；疏血通脈膠囊成人每日劑量為3 g，依上述方法計算得大鼠的等效劑量為0.32 g/kg，疏血通脈膠囊低、中、高劑量組分別為成人等效劑量的1、2、4倍。除假手術(shù)組外，其余5組大鼠均以線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型[10]（造模前禁食12 h，不禁水）：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，固定后，取頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈，分離頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎頸總、頸外動脈。用眼科剪將頸總動脈近分叉處剪一“V”字形切口，將線栓經(jīng)頸外動脈插入頸內(nèi)動脈，直到感覺有阻力時停止進線，并將其稍退出1～2 mm，線栓即到達大腦中動脈起始部，進線深度為（18.0±0.5）mm，此時開始記錄缺血時間，固定線栓，縫合傷口并消毒。缺血1.5 h后進行再灌注，將線栓拔出，恢復(fù)大腦中動脈血供。手術(shù)過程中予以照射燈保持大鼠體溫在（37.0±0.5）℃，并監(jiān)測肛溫、呼吸和心率。假手術(shù)組大鼠線栓插入頸總動脈深度為0.5 mm，其余手術(shù)操作相同。以大鼠蘇醒后爬行時向左轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象），嚴(yán)重時向左跌倒，提尾時左前肢內(nèi)收屈曲為造模成功標(biāo)志。各組大鼠蘇醒后開始灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)28 d。

2.2 神經(jīng)功能缺損評分

在給藥前及給藥后3、7、14、28 d，采用改良神經(jīng)功能評分法（mNSS）對大鼠神經(jīng)功能缺損進行測評[11]。mNSS評分分為運動、感覺、平衡和反射4個部分，總分為18分，正常大鼠評分為0分；評分越低表示神經(jīng)功能缺損程度越輕，詳見表1。

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測

采用TUNEL法檢測大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。給藥后28 d，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg），依次經(jīng)心臟灌注0.9%氯化鈉注射液250 mL和4%多聚甲醛溶液250 mL，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，然后以常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，自視交叉后方開始連續(xù)冠狀位切片，厚度5 ?m，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，得石蠟切片，室溫保存。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化、蛋白酶K室溫孵育15 min后，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.8）漂洗2次（每次5 min），滴加標(biāo)記液50 μL，37 ℃孵育60 min，PBS漂洗3次（每次2 min），加入過氧化物酶50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次（每次2 min），DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封固，于倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈棕黃色顆粒者為凋亡陽性細(xì)胞[12-13]。每只大鼠取4張切片，于每張切片腦梗死側(cè)皮質(zhì)區(qū)隨機選定4個不重疊視野（×200）進行凋亡神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)。

2.4 BDNF表達檢測

采用免疫組化法檢測腦組織大腦皮質(zhì)區(qū)BDNF表達。取“2.3”項下石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、微波熱修復(fù)，以3%過氧化氫室溫孵育5～10 min（以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性），PBS漂洗3次（每次5 min），滴加正常山羊血清封閉液室溫孵育30 min后傾去上清，滴加稀釋后的一抗兔抗大鼠BDNF抗體[工作濃度約為1 ∶ 50（V/V）]，4 ℃過夜，經(jīng)冷PBS漂洗2次（每次5 min）后滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗3次（每次5 min），DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封固，于倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿或細(xì)胞核中有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。每只大鼠取4張切片，于每張切片腦梗死側(cè)皮質(zhì)區(qū)隨機選定4個不重疊視野（×400）進行陽性細(xì)胞計數(shù)。以表達呈陽性的細(xì)胞數(shù)代表BDNF表達情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

假手術(shù)組大鼠在給藥前及給藥后3、7、14、28 d的神經(jīng)功能缺損評分均為0分。與假手術(shù)組同期比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組同期比較，給藥后7、14、28 d尼莫地平組和疏血通脈膠囊低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較見表2。

3.2 各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較

假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)可見少量凋亡神經(jīng)細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，給藥后28 d尼莫地平組和疏血通脈膠囊低、中、高劑量組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況顯微圖見圖1，凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較見表3。

3.3 各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF表達比較

假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)可見BDNF微弱表達的陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF表達顯著增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，給藥后28 d尼莫地平組和疏血通脈膠囊低、中、高劑量組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF表達顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF表達見圖2，BDNF表達陽性細(xì)胞數(shù)比較見表3。

4 討論

缺血缺氧性腦損傷的直接后果是神經(jīng)細(xì)胞凋亡或不可逆性壞死和超微結(jié)構(gòu)損壞[12]。因此，改善神經(jīng)細(xì)胞的生存環(huán)境，抑制缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或壞死，促進原有神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù)以及誘導(dǎo)分化形成新的神經(jīng)細(xì)胞，可能成為缺血缺氧性腦損傷治療的重要途徑[13]。BDNF是神經(jīng)生長因子家族成員之一，是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個部位，以大腦皮質(zhì)、海馬及紋狀體分布最為豐富。BDNF通過與酪氨酸激酶受體的結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中特定神經(jīng)細(xì)胞的表達、分化、生長發(fā)育及突觸可塑性的調(diào)節(jié)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)細(xì)胞的病理狀態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14-15]。BDNF表達高的區(qū)域病理改變輕，有利于損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。造模后大鼠大腦呈缺血的病理狀態(tài)，腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF與其受體的結(jié)合信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，BDNF表達增強，因此高于假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)BDNF的表達。

疏血通脈膠囊由三七、薤白、地龍、瓜蔞皮、冰片組成，方中三七、薤白為君藥，具有化痰、祛瘀、通絡(luò)之功效； 地龍、瓜蔞皮為臣藥，協(xié)同君藥加強活血祛瘀作用；冰片為佐使藥，具有開竅醒神、清熱止痛之功效。全方共奏化痰熄風(fēng)、祛瘀通絡(luò)、痰瘀同治、疏血通脈之功效。研究發(fā)現(xiàn)，三七重要活性成分三七皂苷可在一定程度上改善模型大鼠腦缺血再灌注損傷狀態(tài)[16]，機制可能與其能明顯上調(diào)模型大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)中BDNF蛋白表達有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著增加，表現(xiàn)為神經(jīng)功能障礙。經(jīng)疏血通脈膠囊干預(yù)后，BDNF表達較給藥前增強，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少，大鼠神經(jīng)功能改善。

綜上所述，疏血通脈膠囊能促進腦缺血再灌注后受損神經(jīng)的修復(fù)，改善模型大鼠的神經(jīng)行為功能。其機制可能與增強BDNF表達，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。但其具體機制尚有待更進一步的研究闡明。

參考文獻

[ 1 ] 劉潔，董志，廖楊梅，等. 淫羊藿苷對中動脈阻塞大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及酪氨酸激酶受體B表達的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31（4）：34-37.

[ 2 ] 劉泰，韋必清，韋玉進. 醒腦通脈膠囊對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2005，32（2）：89-91.

[ 3 ] 劉泰，張志偉. 疏血通脈膠囊中醫(yī)理論探源[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2012，23（9）：2295-2297.

[ 4 ] 陳金月，劉泰，周芳，等. 疏血通脈膠囊制備工藝初選及藥效學(xué)比較[J]. 中國藥業(yè)，2013，22（23）：7-8.

[ 5 ] 莫小林，陳金月，周芳，等. 疏血通脈膠囊對小鼠腸系膜微循環(huán)的影響[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，29（3）：4-6.

[ 6 ] 劉泰，周軍，段志剛，等. 疏血通脈膠囊對頸總動脈血栓大鼠血漿纖維蛋白降解產(chǎn)物及D-二聚體的影響[J]. 中醫(yī)雜志，2015，55（1）：61-63.

[ 7 ] CRIGLER L， ROBEY RC， ASAWACHAICHARN A， et al. Human mesenchymal stem cell subpopulations express avariety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis[J]. Exp Neurol，2006，198（1）：54-64.

[ 8 ] 鐘慧霖，陳文明，李翠瑩，等. 移植BDNF和GDNF基因修飾的hMSCs對大鼠大腦中動脈阻塞的影響[J]. 中國病理生理雜志，2014，30（1）：102-109.

[ 9 ] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實驗方法學(xué)[M].3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：203.

[10] LONGA EZ，WEINSLEIN PR，CARLSON S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20（1）：84-91.

[11] LI Y， CHEN J， CHEN XG， et al. Human marrow stromal cell therapyfor troke in rat： Neurotrophins and functional recovery[J]. Neurology，2002，59（4）：514-523.

[12] 歐陽福連，周細(xì)中，方素珍，等. 新生大鼠缺血缺氧性腦損傷遠期行為學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志，2012，14（5）：380-384.

[13] 孫麗，王嶺，李艷，等. 黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用和機制研究[J]. 中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2014，22（1）：43-49.

[14] KIM DH， ZHAO X， TU CH， et al. Prevention of apoptotic but not necrotic cell death following neuronal injury by neurotrophins signaling through the tyrosine kinase receptor[J]. J Neurosurg，2004，100（1） ： 79-87.

[15] TAKEMURA Y， IMAI S， KOJIMA H， et al. Brain-derived neurotrophic factor from bone marrow-derived cells promotes post-injury repair of peripheral nerve[J]. PLoS One，2012，7（9）：445-492.

[16] 方道碩，彭明勇. 三七總皂苷聯(lián)合?；撬釋δX缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用[J]. 中國藥房，2013，24（47）：4436-4438.

[17] 吳蘭鷗，詹合琴，閆俊嶺，等. 三七皂苷Rg1對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及機制探討[J]. 中草藥，2006，37（2）：229-233.

（收稿日期：2017-11-03 修回日期：2017-12-21）

（編輯：張 靜）